肺缺血再灌注損傷模型犬接受去氫駱駝蓬堿干預(yù)后無(wú)明顯肺保護(hù)作用
張皓，齊海，李元明，陳家驊(新疆醫(yī)科大學(xué)**附屬醫(yī)院胸心外科，新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市830063)
文章亮點(diǎn)：
1 實(shí)驗(yàn)采用犬肺常溫缺血再灌注模型，進(jìn)行熱灌注肺保護(hù)液，在國(guó)內(nèi)同類研究中較為少見(jiàn)。
2 有研究表明，去氫駱駝蓬堿有一定的抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化的作用。文章率先通過(guò)分析細(xì)胞因子水平、肺
濕/干質(zhì)量比、肺動(dòng)脈壓力等實(shí)驗(yàn)指標(biāo)探討去氫駱駝蓬堿對(duì)肺的保護(hù)作用，具有一定的**性。
3 實(shí)驗(yàn)選擇短時(shí)間常溫缺血再灌注放大了同等時(shí)間冷缺血再灌注損傷，具有節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物易于耐
受、模型建立操作方便的效果。
關(guān)鍵詞：
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物；組織構(gòu)建；去氫駱駝蓬堿；低鉀右旋糖酐液；缺血再灌注；損傷；肺；常溫；動(dòng)物模型
主題詞：
模型，動(dòng)物；再灌注損傷；肺；右旋糖酐類；哈爾明
摘要
背景：
炎性細(xì)胞活化、氧自由基的產(chǎn)生是肺缺血再灌注損傷發(fā)生的重要因素。在常用的肺保護(hù)液中增加可能具有抑制炎癥、抗氧化作用的**，使保護(hù)液進(jìn)行一定的改良，對(duì)肺缺血再灌注損傷的研究及保護(hù)移植肺的功能具有重要的意義。
目的：
探討去氫駱駝蓬堿對(duì)犬肺缺血再灌注損傷的作用。
方法：將 12 只健康雜交犬隨機(jī)分為兩組，每組 6 只。建立犬肺缺血再灌注損傷模型，采用順灌方式行保護(hù)液肺灌注，實(shí)驗(yàn)組給予低鉀右旋糖苷保護(hù)液+去氫駱駝蓬堿溶液灌注，對(duì)照組給予低鉀右旋糖苷保護(hù)液。缺血2 h 后，恢復(fù)左肺循環(huán)，兩組于再灌注后采集左肺組織及血液標(biāo)本，檢測(cè)細(xì)胞因子水平，計(jì)算肺濕/干質(zhì)量比； 收集支氣管肺泡灌洗液，觀察各項(xiàng)病理指標(biāo)；連續(xù)測(cè)量記錄主肺動(dòng)脈壓、左肺動(dòng)脈壓和右肺動(dòng)脈壓。
結(jié)果與結(jié)論：
兩組于再灌注 2，4 h 時(shí)左肺組織及血液中的白細(xì)胞介素 17、腫瘤壞死因子 α 及內(nèi)皮素 1 水平差異均無(wú)顯著性意義(P> 0.05)，兩組再灌注 4 h 后的支氣管肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞數(shù)目、**細(xì)胞數(shù)目、肺泡損傷指數(shù)及血管壁水腫程度差異均無(wú)顯著性意義(P> 0.05)，兩組肺濕/干質(zhì)量比差異均無(wú)顯著性意義(P> 0.05)，經(jīng)方差分析，兩組主肺動(dòng)脈壓、左肺動(dòng)脈壓及右肺動(dòng)脈壓差異均無(wú)顯著性意義(P> 0.05)。結(jié)果可見(jiàn)通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子、病理指標(biāo)、肺組織濕/干質(zhì)量比及肺動(dòng)脈壓力分析，去氫駱駝蓬堿在犬肺原位常溫缺血再灌注損傷模型中沒(méi)有明顯的肺保護(hù)作用。
張皓，齊海，李元明，陳家驊. 肺缺血再灌注損傷模型犬接受去氫駱駝蓬堿干預(yù)后無(wú)明顯肺保護(hù)作用[J].中國(guó)
組織工程研究，2014，18(36):5805-5812.
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引言
Introduction
隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，器官移植在臨床上成為了現(xiàn)實(shí)和可能。肺移植對(duì)于終末期肺部**是一種有效的**方法[1]，然而，肺缺血再灌注損傷的出現(xiàn)，成為早期移植肺失敗的主要原因，導(dǎo)致移植后發(fā)生原發(fā)性移植肺功能障礙[2]。肺缺血再灌注損傷是某種原因使肺組織遭受一定時(shí)間的缺血，恢復(fù)血液灌流(再灌注)后，缺血、缺氧引起的肺損傷沒(méi)有減輕，反而加重的病理現(xiàn)象[3]。它常見(jiàn)于肺移植、肺葉切除、體外循環(huán)等，尤其在肺移植手術(shù)中發(fā)生率*高[4-6]。因此，減輕肺缺血再灌注損傷以及闡明其發(fā)病機(jī)制已經(jīng)成為亟待解決的難題。多年來(lái)，針對(duì)如何減輕肺缺血再灌注損傷進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究，但極少具有應(yīng)用價(jià)值[7]。研究證實(shí)，目前*為有效、穩(wěn)定的辦法是行保護(hù)液肺灌注。常用的肺保護(hù)液分兩類，一類是細(xì)胞內(nèi)液型(高鉀低鈉)保護(hù)液，以EC(Euro-Collins)液為代表；另一類為細(xì)胞外液型(低鉀高鈉)保護(hù)液，以低鉀右旋糖酐(LPD)液為主。1991年，第2 屆國(guó)際終末期肺**移植會(huì)議明確EC液作為臨床肺保護(hù)液[8]。但學(xué)者們對(duì)兩類不同保護(hù)液的肺保護(hù)作用看法不一，大多數(shù)認(rèn)為：細(xì)胞內(nèi)液型保護(hù)液含有高濃度K+ ，可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞膜內(nèi)K+ 外流，導(dǎo)致細(xì)胞膜靜息電位的**值減小，易使細(xì)胞膜外Na+內(nèi)流，引起細(xì)胞膜去極化、發(fā)生動(dòng)作電位，觸發(fā)Ca通道開(kāi)放、Ca2+向膜內(nèi)流動(dòng)，造成平滑肌細(xì)胞收縮、內(nèi)皮細(xì)胞釋放內(nèi)皮素，從而導(dǎo)致血管收縮，增加肺循環(huán)阻力和促進(jìn)肺部水腫，進(jìn)而加重肺損害。而含有低濃度K+的低鉀右旋糖酐液無(wú)此現(xiàn)象[9]。對(duì)于K+ 濃度的適宜性問(wèn)題，Bando等[10]和Muller等[11]進(jìn)行了深入研究，證實(shí)了細(xì)胞外液型保護(hù)液優(yōu)于細(xì)胞內(nèi)液型保護(hù)液，提出了灌注液K+的濃度不應(yīng)太高也不應(yīng)太低，*適宜在20-40 mmol/L。除此之外，低鉀右旋糖酐液在保護(hù)肺泡上皮功能和內(nèi)皮細(xì)胞新陳代謝方面與EC液比較也有一定的優(yōu)勢(shì)[12]。Gamez等[13]通過(guò)臨床研究報(bào)道，在肺移植后早期恢復(fù)階段，低鉀右旋糖酐液可以明顯降低約50%的肺缺血再灌注損傷發(fā)生率。因此對(duì)于肺保護(hù)來(lái)說(shuō)，特別是在早期移植物功能的保護(hù)方面，細(xì)胞外液型保護(hù)液較細(xì)胞內(nèi)液型更有應(yīng)用價(jià)值[14]?，F(xiàn)今，臨床**和實(shí)驗(yàn)研究中多使用低鉀右旋糖酐液作為肺保護(hù)液的優(yōu)選，除低濃度鉀對(duì)血管有保護(hù)作用外，還認(rèn)為含有的葡萄糖可以為細(xì)胞供能以及增加能量?jī)?chǔ)備，提高移植肺的功能。Chu等[15]提出，在保護(hù)液中添加其他保護(hù)成分比單純使用肺保護(hù)液更有價(jià)值。如有學(xué)者報(bào)道在低鉀右旋糖酐液中增加參附注射液、谷胱甘肽、西地那非等，都取得了較好的肺保護(hù)效果。因此在肺保護(hù)液中添加**成分，對(duì)其進(jìn)行改良，成為減輕肺缺血再灌注損傷研究的重點(diǎn)和方向。
去氫駱駝蓬堿又稱為哈爾明堿(harmine，HM)，為β-咔啉類生物堿，是植物駱駝蓬種子中的主要成分[16-17]。近幾年，不少學(xué)者對(duì)去氫駱駝蓬堿的藥理作用進(jìn)行了研究，得出不同的結(jié)論。Khan等
[16]發(fā)現(xiàn)去氫駱駝蓬堿對(duì)用腎上腺素和氯化鉀溶液處理后收縮的大鼠離體胸部大動(dòng)脈有血管舒張作用，其機(jī)制與促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放血管舒張因子及微弱的與Ca2+通道結(jié)合，非競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ca
2+內(nèi)流作用有關(guān)。Berrougui等[18]研究認(rèn)為駱駝蓬堿能夠舒張血管，去氫駱駝蓬堿則無(wú)此作用。Moura等[19]研究提出去氫駱駝蓬堿可以作為活性氧的**劑。Chen等[20]及Yamazaki等
[21]研究發(fā)現(xiàn)去氫駱駝蓬堿可以抑制腫瘤壞死因子α、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的產(chǎn)生，來(lái)發(fā)揮**作用。
Bi等[22]通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)去氫駱駝蓬堿能夠減輕腸系膜缺血再灌注損傷，提出活性氧增多和炎性細(xì)胞活化在缺血再灌注損傷中扮演重要角色，認(rèn)為β-咔啉類生物堿具有潛在的抗氧化能力。
目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道中，尚未見(jiàn)有關(guān)去氫駱駝蓬堿對(duì)肺缺血再灌注損傷作用的研究。本實(shí)驗(yàn)對(duì)低鉀右旋糖酐液進(jìn)行改良(加入去氫駱駝蓬堿液)，以犬模擬臨床肺移植過(guò)程中出現(xiàn)的肺缺血再灌注損傷，通過(guò)觀測(cè)白細(xì)胞介素17、腫瘤壞死因子α、內(nèi)皮素1、肺泡損傷指數(shù)、支氣管肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞及**細(xì)胞數(shù)目、肺濕/干質(zhì)量比、肺動(dòng)脈壓等實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，探討去氫駱駝蓬堿對(duì)犬肺缺血再灌注損傷的影響及可能機(jī)制。
1材料和方法 Materials and methods
設(shè)計(jì)：隨機(jī)對(duì)照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
時(shí)間及地點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)于2009年9月至2012年11月在新疆醫(yī)科大學(xué)**附屬醫(yī)院外科實(shí)驗(yàn)中心完成。
材料：
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：
健康成年雜交犬12只，雌雄不限，體質(zhì)量 20-31 kg，平均(27.333±3.339) kg，犬齡12-16個(gè)月，平均(13.668±1.435)個(gè)月，由新疆醫(yī)科大學(xué)**附屬醫(yī)院外科實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)前1周進(jìn)行動(dòng)物觀察，手術(shù)前給予禁食12 h，禁水4 h。12只犬的體質(zhì)量、性別、年齡經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)顯著性意義。該實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)**附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物得到了人道關(guān)懷。
實(shí)驗(yàn)方法：
實(shí)驗(yàn)分組：對(duì)實(shí)驗(yàn)犬依次編號(hào)(1-12號(hào))，按照隨機(jī)排列表方法將12只犬分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組6只。實(shí)驗(yàn)組為低鉀右旋糖苷+去氫駱駝蓬堿保護(hù)液灌洗組；對(duì)照組為低鉀右旋糖苷保護(hù)液灌洗組。
建立犬肺原位常溫缺血再灌注損傷動(dòng)物模型：
①術(shù)前 準(zhǔn)備：室溫27℃，呼吸機(jī)、心電監(jiān)護(hù)儀安放于手術(shù)臺(tái)一側(cè)， 手術(shù)器械擺放在手術(shù)托盤(pán)上，犬禁食12 h，禁水4 h。②麻 醉處理：實(shí)驗(yàn)犬肌注阿托品，靜脈給予芬太N(10 μg/kg)、 丙泊酚(2 mg/kg)進(jìn)行**麻醉。麻醉起效后，取仰臥位、備皮，四肢固定于手術(shù)臺(tái)上。插導(dǎo)尿管接尿袋，**管插管接呼吸機(jī)，機(jī)械通氣：潮氣量15-20 mL/kg，頻率20次/min， 氧濃度為60%。行持續(xù)心電監(jiān)測(cè)，于左或右側(cè)頸外靜脈處插管，給予生理鹽水溶液滴注維持。③手術(shù)操作：備皮區(qū)碘伏**3遍，鋪無(wú)菌巾。選擇雙側(cè)第4或第5肋間，作橫行切口，離斷胸骨進(jìn)入胸腔?？v行切開(kāi)心包并懸吊(左側(cè)部 分懸吊)，解剖肺動(dòng)脈主干及左右各支、左右肺靜脈上中下各支及左主支氣管并充分游離、暴露。主肺動(dòng)脈近心端插入測(cè)壓管，荷包縫合固定，持續(xù)記錄犬主肺動(dòng)脈壓、左右肺動(dòng)脈壓(測(cè)定時(shí)阻斷對(duì)側(cè))，采用間歇測(cè)定法，每30 min/次。 左肺動(dòng)脈遠(yuǎn)心端置入灌注管，荷包縫合固定。測(cè)壓管、灌注管內(nèi)推注低分子肝素鈉(1 mL/kg)。阻斷前左肺充氣膨脹，右肺動(dòng)脈繞帶備阻斷。用阻斷鉗夾閉左肺動(dòng)脈近心端，直角鉗阻斷左主支氣管，縫線結(jié)扎左肺**管及左側(cè)支氣管動(dòng)靜脈。左肺上中下葉靜脈近心端阻斷，遠(yuǎn)心端造口。從左肺動(dòng)脈灌注管內(nèi)灌注37 ℃保護(hù)液，壓力維持在18 mm Hg (1 mm Hg=0.133 kPa)，灌洗量以60 mL/kg計(jì)算，采用順灌方式進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)組予低鉀右旋糖苷保護(hù)液+去氫駱駝蓬堿溶液灌注，對(duì)照組予低鉀右旋糖苷保護(hù)液。左肺常溫阻斷2 h后，予相應(yīng)灌洗液左肺血管沖洗。拔出灌注管，結(jié)扎左肺動(dòng)脈荷包縫合，左肺各支靜脈造口處縫線打結(jié)閉合。 *后開(kāi)放左肺動(dòng)脈及左主支氣管，恢復(fù)左肺循環(huán)，呼吸機(jī)調(diào)整為雙肺通氣。④標(biāo)本留?。鹤蠓卧俟嘧? h后，取雙側(cè)等量肺組織，制備成肺組織勻漿標(biāo)本。抽血液10 mL于抗凝試管并放置在離心機(jī)中，以轉(zhuǎn)速1 500 r/min進(jìn)行離心。5 min后取出試管，將上層血清吸出留取血清標(biāo)本。左肺再灌注4 h后，取各犬左側(cè)等量肺組織，用于肺組織濕/干質(zhì)量比(W/D)的測(cè)定。其余標(biāo)本留取方法同上。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，從氣管中插入灌洗管至左肺組織，留置支氣管肺泡灌洗液標(biāo)本。將所有標(biāo)本存放于-80℃冰箱中，以備檢測(cè)。
肺組織及血液白細(xì)胞介素17、腫瘤壞死因子α、內(nèi)皮素1的測(cè)定：將再灌注2，4 h時(shí)采集的肺組織勻漿及血液標(biāo)本從-80℃冰箱中取出，運(yùn)用ELISA檢測(cè)試劑盒，對(duì)樣品濃度進(jìn)行測(cè)定。操作步驟如下：①取出酶聯(lián)板，設(shè)立空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔及待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00μL，標(biāo)準(zhǔn)孔加標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，待測(cè)樣品孔加實(shí)驗(yàn)標(biāo)本100 μL。②每孔加檢測(cè)溶液A、B工作液100μL，酶標(biāo)板加上覆膜，在37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)反應(yīng)60 min。③溫育60 min后，棄 去孔內(nèi)液體，甩干并洗板。④每孔加底物溶液90 μL，酶標(biāo)板加上覆膜，在37 ℃環(huán)境下避光顯色。⑤每孔加終止溶液 50 μL，進(jìn)行終止反應(yīng)，即藍(lán)色變?yōu)辄S色。⑥用酶聯(lián)儀在450 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，計(jì)算吸光度值。⑦得出數(shù)值后， 在電腦上運(yùn)用軟件(curve expert 1.3)繪制曲線，對(duì)白細(xì)胞介素17、腫瘤壞死因子α、內(nèi)皮素1水平進(jìn)行計(jì)算分析。
