侯永春 嚴(yán) 孜1 ( 江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)
〔摘 要〕 目的 觀察參苓散對(duì)脾陰虛癡呆( AD) 大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子( BDNF) 、神經(jīng)生長(zhǎng)因子( NGF) 表達(dá)的影響。方法 將 48 只體重( 300 ± 20) g 的健康雄性大鼠，隨機(jī)分成空白組( 空白對(duì)照) 、陰虛組( 脾陰虛) 、AD 組( 脾陰虛 + AD) 和 組( 脾陰虛 + AD ) ，每組 12 只。通過(guò)病證結(jié)合的方法建立脾陰虛 AD 大鼠模型，組給予中藥參苓散灌胃，每日1 ml /100 g，持續(xù)10 d，其他各組每日予等體積生理鹽水灌胃。采用Morris 水迷宮測(cè)試各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，用疫組化( SP) 方法觀察大鼠海馬區(qū)BDNF 和NGF 的表達(dá)。結(jié)果 ① 造模后，陰虛組、AD 組、 組與空白組對(duì)比逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少( P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01) ; 給予參苓散后，組與陰虛組、AD 組相比，大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺(tái)次數(shù)增多( P ＜ 0. 01) ; ②與空白組比較，陰虛組、AD 組大鼠海馬 BDNF、NGF 表達(dá)明顯下調(diào)( P ＜ 0. 01) ; 而組大鼠海馬 BDNF、NGF 表達(dá)與陰虛組、AD 組比較明顯上調(diào)( P ＜ 0. 01) 。結(jié)論 參苓散能改善脾陰虛 AD 模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，增加其海馬區(qū) BDNF、NGF 表達(dá)。
〔關(guān)鍵詞〕 參苓散; 癡呆; 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子; 神經(jīng)生長(zhǎng)因子
〔中圖分類號(hào)〕 Ｒ749 〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕 A 〔文章編號(hào)〕 1005-9202( 2014) 03-0728-03; doi: 10. 3969 / j. issn. 1005-9202. 2014. 03. 075
老年性癡呆( AD) 是一種樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性**，其進(jìn)行性的認(rèn)知功能障礙學(xué)習(xí)和記憶能力減退〔1〕。中醫(yī)發(fā)現(xiàn)這一病癥與脾虛濕勝、腦竅失養(yǎng)癥狀相似; 同時(shí)臨床上也多用補(bǔ)脾益腎增智的方劑。參苓散具有益心力，除謬忘，能飲食，延年益壽的功效。近幾年來(lái)發(fā)現(xiàn)大腦海馬區(qū)神經(jīng)因子數(shù)量減少和功能障礙在脾陰虛 AD 發(fā)生與發(fā)展中起到越來(lái)越重要的作用〔2〕。本研究觀察參苓散對(duì)脾陰虛 AD 大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用，用疫組化( SP) 方法觀察大鼠海馬神經(jīng)因子表達(dá)的變化，為防治脾陰虛 AD 病提供科學(xué)證據(jù)。
1 材料與方法
1. 1 材 料
1. 1. 1 動(dòng)物 選用清潔級(jí)健康雄性 SD 大鼠 48 只，江西中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào) 2011-50，體重( 300 ± 20) g，環(huán)境溫度( 25 ± 2) ℃ ，自然晝夜節(jié)律，顆粒飼料飼養(yǎng)，自由飲水。
1. 1. 2 藥品與試劑 參苓散( 藥包括茯苓、人參、甘草等份自配，常規(guī)水煎，藥液含生藥 3. 2 g / ml) 和傷陰藥( 吳茱萸、附子等，常規(guī)水煎，藥液含生藥 1 g / ml) 江西南華制藥有限公司; 鈉注射液，江西科倫藥業(yè)有限公司; 3-氨丙基-3-乙氧基甲硅烷( APES) ; 抗兔 SP 試劑盒，中性磷酸鹽緩沖溶液( PBS) ; 二氨基聯(lián)苯胺( DAB) 顯色劑( 均為中杉金橋) 。
1. 1. 3 儀器 2135 型石蠟切片機(jī)( Leica，德國(guó)) ，展片、烤片機(jī)( 山東紅旗儀器廠，中國(guó)) ，DT10K 型電子天平( 江蘇常熟長(zhǎng)青儀器儀表廠，中國(guó)) ，恒溫箱兼培養(yǎng)箱( 上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠， 中國(guó)) ，BX-41 型顯微照相儀( OLYMOUS，日本) ，DB001 型 Mor- ris 水迷宮( 北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司，中國(guó)) 。
1. 2 方法
1. 2. 1 動(dòng)物分組 48 只健康雄性大鼠稱重后，隨機(jī)分成四組: 空白組( 空白對(duì)照) 、陰虛組( 脾陰虛) 、AD 組( 脾陰虛 + AD) 和組( 脾陰虛 + AD +) ，每組 12 只。
1 江西中西藥大學(xué)科技學(xué)院
**作者: 侯永春( 1979-) ，男，講師，主要從事中藥藥理學(xué)研究。
1. 2. 2 動(dòng)物模型復(fù)制及給藥
1. 2. 2. 1 脾陰虛證模型 首先對(duì)陰虛組、AD 組和組大鼠參照經(jīng)典的復(fù)合因素造模法〔3〕進(jìn)行脾陰虛模型的建立，分為脾氣虛和脾陰虛兩個(gè)階段。實(shí)驗(yàn)第 1 ～ 15 天為脾氣虛階段，大鼠單日自由游泳達(dá)到耐力極限，禁食飼料，喂甘蘭( 30 g / 只) ; 雙日予豬油脂灌服; 空白組正常喂養(yǎng)，予等量生理鹽水灌服。第 16 ～ 24 天為脾陰虛階段，在脾氣虛的基礎(chǔ)上每日增加傷陰藥 1 ml /100 g ，連續(xù)灌服。而空白組大鼠僅予等體積生理鹽水灌服。
1. 2. 2. 2 脾陰虛 + AD 模型 AD 組、組大鼠繼續(xù)進(jìn)行AD 模型〔4〕的建立，用 MILLIQ 水將 Aβ1 ～ 40稀釋成 5 μg / μl，37℃ 孵育1 w，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)備用。大鼠經(jīng)腹腔注射2% 鈉( 45 mg / kg) 麻醉后，固定到腦立體定位儀，常規(guī)備皮**，切開(kāi)皮膚; 選擇雙側(cè)海馬為注射靶區(qū)，取前囟后 3. 5 mm ， 中線旁 2. 0 m ，門齒鉤平面低于耳間線平面 3. 3 mm 處鉆開(kāi)顱骨，暴露硬腦膜，微量注射器自腦表面緩慢垂直進(jìn)針至硬腦膜下2. 5 mm，AD 各組每側(cè)予以2 μl 淀粉樣蛋白酶( Aβ1 ～ 40 ) 溶液緩慢注入，留針以保證溶液充分彌散，緩慢撤針，縫合切口，皮下注射抗生 防止感染; 空白組和陰虛組大鼠進(jìn)行同樣手術(shù)， 僅注入等體積 MILLIQ 水，術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)。
1. 2. 3 藥干預(yù) 術(shù)后第 4 天對(duì)組大鼠給予中藥參苓散灌胃，每日 1 ml /100 g，持續(xù) 10 d，而其余各組大鼠每日予等體積生理鹽水灌胃。
1. 2. 4 Morris 水迷宮試驗(yàn) 采用 Morris 水迷宮測(cè)試各組大鼠造模前、造模后、后學(xué)習(xí)記憶能力; 具體方法參照 Morris 等〔5〕的方法，分別于 AD 造模術(shù)前、造模術(shù)后第 3 天及結(jié)束后評(píng)價(jià)各組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺(tái)的次數(shù)。
1. 2. 5 標(biāo)本制備 各組大鼠在進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，立即以致死量 100 g / L 水合氯醛( 350 mg / kg) 腹腔麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，剪開(kāi)胸腔，暴露心臟，從心尖插入灌注針至左心室，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，快速滴入 37℃ 生理鹽水 300 ml，無(wú)血污后改為滴入固定液 4℃ 的多聚甲醛 400 ml。待大鼠尾巴完全僵直時(shí)迅速斷頭，取出海馬組織，固定于 4% 多聚甲醛溶液中 12 ～24 h，進(jìn)行脫水透明及石蠟包埋。冠狀面連續(xù)切片，厚度約3 μm，用經(jīng)多聚賴氨酸處理過(guò)的載玻片撈片，晾干后置于 60℃
的烤箱中烘烤備用。
1. 2. 6 腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子( BDNF) 、神經(jīng)生長(zhǎng)因子( NGF) 疫組化檢測(cè) 采用 疫組化 SP 法檢測(cè) BDNF 及 NGF 的表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑說(shuō)明書操作要求進(jìn)行檢測(cè)。在海馬區(qū)隨機(jī)選擇 8 個(gè)視野，用顯微圖像分析系統(tǒng)下的目鏡，400 倍顯微計(jì)數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)平均數(shù)。
1. 
3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用 SPSSV11. 5 軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以 x ± s 表示，組間兩兩比較采用多組定量資料的單因素方差分析 LSD 法。
2 結(jié) 果
2. 1 定位航行試驗(yàn) 造模前各組大鼠定位航行試驗(yàn)逃避潛伏期無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P ＞ 0. 05) ，具有可比性; 造模后，陰虛組、AD 組、組與空白組對(duì)比逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)( P ＜ 0. 05 或P ＜ 0. 01) 。給予中藥參苓散灌胃后，與陰虛組、AD 組相比，組逃避潛伏期明顯縮短( P ＜ 0. 05) 。見(jiàn)表 1。
2. 2 空間探索試驗(yàn) 造模前各組大鼠空間探索試驗(yàn)穿越平臺(tái)次數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異( P ＞ 0. 05) ，且有可比性。造模后，陰虛組、AD 組、組與空白組對(duì)比穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少( P ＜0. 01) ; 其中組、AD 組與陰虛組比較，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少( P ＜ 0. 01) 。給予中藥參苓散灌胃后，與陰虛組、AD 組相比，組穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加( P ＜ 0. 01) 。見(jiàn)表 2。
2. 3 各組大鼠 BDNF、NGF 表達(dá)情況 與空白組比較，陰虛組、AD 組大鼠海馬 BDNF、NGF 表達(dá)明顯下調(diào)( P ＜ 0. 01) ; 而組與陰虛組、AD 組比較明顯上調(diào)( P ＜ 0. 01) 。見(jiàn)表 3、圖 1。
3 討 論
AD 呈逐年上升的趨勢(shì)，至今還沒(méi)有令人滿意的方法， 中** AD 給人們提出了新思路。本研究結(jié)果表明參苓散灌服能夠明顯提高脾陰虛 AD 大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力，改善認(rèn)知功能。
海馬結(jié)構(gòu)作為大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，在學(xué)習(xí)和記 憶等上等神經(jīng)活動(dòng)中起關(guān)鍵作用，海馬神經(jīng)元損害可能是 AD 的重要病理基礎(chǔ)之一。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是一類對(duì)神經(jīng)有特異性的蛋白質(zhì)，BDNF 和 NGF 就是其中的代表。隨著對(duì)其深入研究，人們發(fā)現(xiàn)它們具有明確的促進(jìn)和維持神經(jīng)細(xì)胞分化、生長(zhǎng) 和存活作用，在改善認(rèn)知功能方面也有重要作用〔6 ～ 8〕。但中藥方參苓散能否促進(jìn)慢性腦缺血大鼠 BNF 的表達(dá)，目前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果提示參苓散能通過(guò)啟動(dòng) BDNF 的表達(dá)加強(qiáng)腦缺血后的內(nèi)源性修復(fù)過(guò)程，這可能是內(nèi)服參苓散后機(jī)體 對(duì)腦進(jìn)行保護(hù)作用的一種機(jī)制。
AD 屬中醫(yī)學(xué)的“癡證”、“呆病”等范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為引起本病的基本原因是肝腎虧虛、氣血不足、經(jīng)脈失養(yǎng)、髓海不足。 而脾胃為后天化生之源，脾胃氣健則先天腎氣充實(shí)，髓海得養(yǎng)。 參苓散方中人參大補(bǔ)元?dú)?span>，