荔枝核總黃酮對膿毒癥大鼠腸損傷的保護作用
王 璐1 ，姚 蘭1 ，張 爽2 ，劉玉蘭1 ，柳 舟1 ，鄒捍東1
( 1． 武漢大學(xué)人民醫(yī)院，湖北 武漢 430060; 2． 湖北科技學(xué)院護理學(xué)院，湖北 咸寧 437000)
［摘要］ 目的 探討荔枝核總黃酮對膿毒癥大鼠腸損傷的保護作用。方法 將 64 只Wistar 大鼠隨機分為假手術(shù)組、膿毒癥組、荔枝核總黃酮假手術(shù)組、荔枝核總黃酮組，每組 16 只。膿毒癥組和荔枝核總黃酮組大鼠均采用腹主動脈阻斷術(shù)聯(lián)合腹腔注射脂多糖( LPS) 的方法構(gòu)建嚴重膿毒癥模型; 假手術(shù)組和荔枝核總黃酮假手術(shù)組僅分離腹主動脈但不夾閉，不注射 LPS，僅于相應(yīng)時點腹腔注射等量生理鹽水。術(shù)后第 2 天開始，假手術(shù)組和膿毒癥組給予 0． 9% 氯化鈉溶液 5 mL / ( kg·d) 灌胃，荔枝核總黃酮組及荔枝核總黃酮假手術(shù)組均給予荔枝核總黃酮 150 mg / ( kg·d) 灌胃，均每天 1 次，共 7 d。各組手術(shù) 8 h 后采血，檢測血清中 C 反應(yīng)蛋白( CRP) 、白細胞介素 － 6( IL － 6) 、腫瘤壞死因子 － α( TNF － α) 水平; 7 d 后取小腸組織，檢測一氧化氮合酶( NOS) 活力及一氧化氮( NO) 、超氧化物歧化酶( SOD) 、丙二醛( MDA) 、谷胱甘肽過氧化物酶( GSH － Px) 含量。結(jié)果 荔枝核總黃酮組大鼠生存率明顯高于膿毒癥組( P ＜ 0． 05) ，但仍低于假手術(shù)組( P ＜ 0． 05) 。膿毒癥組血清 CRP、IL － 6、TNF － α 水平均明顯高于假手術(shù)組( P 均 ＜ 0． 05) ，荔枝核總黃酮組血清 CRP、IL － 6、TNF － α 水平均明顯低于膿毒癥組( P 均 ＜ 0． 05) 。膿毒癥組大鼠腸組織中 NO、MDA 含量和 NOS 活力均明顯高于假手術(shù)組 ( P 均 ＜ 0． 05) ，SOD 和 GSH － Px 含量均明顯低于假手術(shù)組( P 均 ＜ 0． 05) ; 荔枝核總黃酮組大鼠腸組織中 NO、MDA 含量和 NOS 活力均明顯低于膿毒癥組( P 均 ＜ 0． 05) ，SOD 和 GSH － Px 含量均明顯高于膿毒癥組( P 均 ＜ 0． 05) ; 荔枝核總黃酮假手術(shù)組各指標與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義( P 均 ＞ 0． 05) 。結(jié)論 荔枝核總黃酮可以增強機體抗氧化能力，減輕炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷，從而達到保護膿毒癥腸損傷的目的。
［關(guān)鍵詞］ 荔枝核總黃酮; 膿毒癥; 腸損傷; 炎癥反應(yīng); 氧化應(yīng)激
膿毒癥是指由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征，ICU 內(nèi)病死率為 30% ～ 70%［1］。腸道在膿毒癥的發(fā)**展中起重要作用，甚至是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵器官。膿毒癥發(fā)生時，炎性反 應(yīng)因子增加，腸道內(nèi)環(huán)境平衡紊亂，腸上皮細胞凋亡增多，腸 道黏膜屏障受到破壞，腸黏膜通透性發(fā)生改變，致使腸道菌群 失調(diào)，進而引發(fā)全身炎癥反應(yīng)，危及患者生命［2］。目前，臨床 尚未成功開發(fā)出有針對性地**膿毒癥腸道損傷的有效藥 物。研究發(fā)現(xiàn)，荔枝核黃酮類化合物有抗氧化應(yīng)激、**、**調(diào)理等作用［3］，故本研究應(yīng)用腹主動脈阻斷術(shù)聯(lián)合腹腔注射脂多糖( LPS) 方法構(gòu)建嚴重膿毒癥大鼠模型，探討了荔枝核總黃酮對膿毒癥腸損傷的保護作用及抗氧化機制，旨在為 其用于膿毒癥腸損傷的**提供實驗依據(jù)。
1 實驗資料
1. 1 實驗動物 SPF 級雄性 Wistar 大鼠 64 只( 湖北省**控 制中心實驗動物中心提 供，動 物 合 格 證 號: 11400700239487) ，體質(zhì)量(240 ± 20) g。
1. 2 藥品、試劑及儀器 LPS 由 Sigma 公司提供;兔抗大鼠腫瘤壞死因子 － α( TNF － α) 抗體和兔抗大鼠白細胞介素 － 6 ( IL － 6 ) 抗體由武漢博士德生物有限公司提供; 一氧化氮( NO) 、一氧化氮合酶( NOS) 、丙二醛( MDA) 、超氧化物歧化酶( SOD) 、谷胱甘肽過氧化物酶( GSH － Px) 均由南京建成生物所提供。微量注射儀( 北京智鼠多寶生物科技有限責任公司);電子天平( SARTOR2US，BP211，德國生產(chǎn)) ;8021 離心機 ( 上海手術(shù)器械廠);GF － D200 半自動生化分析儀( 山東高密彩虹分析儀器有限公司);723 分光光度儀( 上海精密儀器儀表有限公司)。
1. 3 分組、模型制備及處理 按隨機數(shù)字表將大鼠隨機分為假手術(shù)組、膿毒癥組、荔枝核總黃酮假手術(shù)組、荔枝核總黃酮組，每組 16 只。膿毒癥組和荔枝核總黃酮組大鼠均予以 45 mg / kg wu***鈉腹腔注射麻醉后取右側(cè)臥位，經(jīng)側(cè)腹切口， 腹膜后分離出腹主動脈，行腹主動脈阻斷再灌注 2 h 腹腔注射 LPS 20 mg / kg;假手術(shù)組和荔枝核總黃酮假手術(shù)組僅分離腹主動脈但不夾閉，不注射 LPS，僅于相應(yīng)時點腹腔注射等量生理鹽水。術(shù)后第 2 天開始，假手術(shù)組和膿毒癥組給予9% 氯化鈉溶液 5 mL /( kg·d) 灌胃，荔枝核總黃酮組及荔枝核總黃酮假手術(shù)組均給予荔枝核總黃酮 150 mg /( kg·d) 灌胃，均每天 1 次，共 7 d，第 7 天末各組大鼠全部處死，留取腸組織。4 炎癥因子檢測 各組大鼠分別于造模成功后 8 h 采血， 全血 3 000 r / min 離心 15 min 后取血清 － 80 ℃ 凍存，用于檢測血清中 C 反應(yīng)蛋白( CRP) 、IL － 6、TNF － α 水平。
1. 5 抗氧化因子檢測 取各組大鼠小腸組織，按 1∶ 9 加入冷生理鹽水制成濃度為 10% 的大鼠腸組織勻漿液，參考 NO、NOS、MDA、SOD 和 GSH － Px 活性試劑盒說明書操作方法進行相應(yīng)指標測定。
1. 6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)結(jié)果均采用 x珋± s 表示，經(jīng)由統(tǒng)計軟件 SPSS 17． 0 進行單因素方差分析并行 LSD － t 檢驗，P ＜0. 05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié) 果
2. 1 各組大鼠生存率比較 假手術(shù)組和荔枝核總黃酮假手術(shù)組大鼠于實驗過程中全部存活。膿毒癥組術(shù)后 7 d 大鼠生存率為 37． 5% (6 /16) ，荔枝核總黃酮組為 75% (12 /16) ，荔枝核總黃酮組大鼠生存率明顯高于膿毒癥組( P ＜ 0． 05) ，但仍低于假手術(shù)組( P ＜ 0． 05)。
2. 2 各組大鼠血清 CRP、IL － 6、TNF － α 水平比較 膿毒癥組血清 CRP、IL － 6、TNF － α 水平均明顯高于假手術(shù)組(P 均 ＜0. 05) ，荔枝核總黃酮組血清 CRP、IL － 6、TNF － α 水平均明顯低于膿毒癥組( P 均 ＜ 0． 05)。見表 1。
2. 3 各組大鼠腸組織中 NOS 活力及 NO、MDA、SOD、GSH － Px 含量比較 膿毒癥組大鼠腸組織中 NO、MDA 含量和 NOS 活力均明顯高于假手術(shù)組( P 均 ＜ 0． 05) ，SOD 和 GSH － Px 含量均明顯低于假手術(shù)組( P 均 ＜ 0． 05);荔枝核總黃酮組大鼠腸組織中 NO、MDA 含量和 NOS 活力均明顯低于膿毒癥組( P 均 ＜ 0． 05) ，SOD 和GSH － Px 含量均明顯高于膿毒癥組(P 均 ＜0. 05);荔枝核總黃酮假手術(shù)組各指標與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義( P 均 ＞ 0． 05)。見表 2。
3 討 論
膿毒癥的發(fā)病機制復(fù)雜，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥導(dǎo)致的器官損傷與氧化應(yīng)激密切相關(guān)［4］。感染可以誘導(dǎo)和激 活誘導(dǎo)型一氧化氮合酶( iNOS) 活性增強，催化 NO 的產(chǎn)生，導(dǎo)致血液及組織中 NO 含量顯著升高。過多的 NO 在組織細胞內(nèi)蓄積并擴散到臨近細胞內(nèi)，導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)中的多種成分發(fā)生過氧化反應(yīng)、細胞功能破壞［5］，從而導(dǎo)致細胞死亡。SOD是體內(nèi)** ROS 的主要抗氧化酶，可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復(fù)受損細胞，復(fù)原因自由基造成 的細胞損傷。MDA 是細胞膜上不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要終產(chǎn)物之一，其含量可以反映體內(nèi)氧化應(yīng)激損 傷的程度［6］。GSH － Px 是一種過氧化物分解酶，可以特異性地催化還原型谷胱甘肽( GSH) 對氫過氧化物的還原反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，GSH － Px 在細胞內(nèi)能**有害的過氧化物代謝產(chǎn)物，阻斷脂質(zhì)過氧化連鎖反應(yīng)，從而起到保護細胞膜結(jié)構(gòu)和功 能完整性的作用［7］。
荔枝核是無患子科植物荔枝的成熟種子，味甘、微苦，性溫，歸肝、腎經(jīng)，有**散結(jié)、祛寒止痛之功效。研究發(fā)現(xiàn)，荔枝核中有效成分荔枝核總黃酮可通過**氧自由基，調(diào)節(jié)線粒體功能障礙，通過抗脂質(zhì)過氧化和抗凋亡作用保護肝功能［8 － 10］。葉紅梅等［11］研究發(fā)現(xiàn)荔枝核皂苷可以明顯提高學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠腦組織中 SOD 和 GSH － Px 含量，降低腦組織中 MDA、NO 含量和 NOS 活性。Yamanishi 等［12］ 研究發(fā)現(xiàn)富含黃酮的荔枝核提取物可以抑制大鼠肝炎細胞模型中 iN- OS 基因 mRNA 和蛋白水平的表達，從而減少 IL － 1β 誘導(dǎo)的NO，還可以抑制 iNOS 基因的轉(zhuǎn)錄。Zhou 等［13］發(fā)現(xiàn)荔枝核總黃酮可促進小鼠巨噬細胞中 PGE2 和 NO 的合成，且可通過調(diào)節(jié) COX － 2 的水平和 iNOS mRNA 的表達介導(dǎo)感染后的**過程。本研究發(fā)現(xiàn)荔枝核總黃酮可以延長膿毒癥大鼠的壽命，降低血清 CRP、IL － 6 和 TNF － α 水平，減輕炎癥反應(yīng);還可以降低膿毒癥大鼠腸組織中 NO、MDA 含量和 NOS 活性， 提高 SOD 和 GSH － Px 活性。
綜上所述，荔枝核總黃酮能保護膿毒癥腸損傷，減輕炎癥 反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，但該組分的進一步細分、提純以及其抗 氧化調(diào)控機制還有待進一步研究。