天津醫(yī)科大學(xué)/安定醫(yī)院精神科強(qiáng)迫游泳

單次長時(shí)程應(yīng)激對(duì)大鼠杏仁核激活的影響

黃庚娣1      方青1，2       王承展1，2        楊建立1，2＊＊

1 ( 天津醫(yī)科大學(xué)，天津，300070)

2 ( 天津市安定醫(yī)院精神科，天津，300074)

    傷后應(yīng)激障礙 ( PTSD)  是一種慢性的、衰竭性的精神障礙，發(fā)生于極端恐懼的經(jīng)歷后，其癥狀主要表現(xiàn)在高喚醒狀態(tài)、驚嚇反應(yīng)增強(qiáng)、對(duì)創(chuàng)傷事件的再體驗(yàn)、對(duì)創(chuàng)傷相關(guān)線索的回避及情感麻木［1］，其病理機(jī)制依舊不明。建立與人 PTSD 臨床癥狀符合、有效的動(dòng)物模型仍然是目前 PTSD 發(fā)病機(jī)制研究的關(guān)鍵［2 － 4］。單程長時(shí)應(yīng)激模型( single prolonged stress paradigm，SPS ) 是PTSD 行為敏感化常用的應(yīng)激模型之一，能夠較好模擬 PTSD 發(fā)病過程及患者出現(xiàn)的核心癥狀，并廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)研究中。SPS 模型是一個(gè)連續(xù)的過程，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物依次進(jìn)行 2 h 束縛( 軀干和四肢禁錮在塑料盒中，尾巴露在外面) 后，立即強(qiáng)迫性游泳 20 min( 20 － 24℃ ) ，然后休息 15 min 恢復(fù)，*后使用乙醚麻醉直到意識(shí)喪失［5 － 6］。

      杏仁核是主要邊緣系統(tǒng)的皮層下**，對(duì)條件 性或非條件性的感官刺激進(jìn)行植物神經(jīng)、***及行為反應(yīng)的情緒調(diào)控的關(guān)鍵腦區(qū)［7］，主要包括基地外側(cè)杏仁核( basolateral amygdala，BLA) 和中央杏仁核( central amygdala，CeA) ，其中 BLA 主要負(fù)責(zé)感覺信息的輸入和處理，而 CeA 主要負(fù)責(zé)恐懼行為的表達(dá)［8］。研究表明，PTSD 的恐懼性記憶、易激惹、高喚醒等癥狀與大腦杏仁核、內(nèi)側(cè)前額葉皮層  ( medical prefrontal cortex，mPFC) 和海馬密切相關(guān)， 其中，杏仁核可能是影響 PTSD 癥狀的關(guān)鍵核團(tuán)［2］。影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，PTSD 患者的杏仁核在條件性恐懼記憶的獲得中顯著激活［4］。因此，我們將應(yīng)用 SPS 模型，觀察大鼠 PTSD 樣癥狀中形成過程中杏仁核的激活情況，探究 PTSD 的可能神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制。材料與方法

1． 1  實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Sprague － Dawley( SD) 大鼠，♂，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào): SCX( 京) 2001 － 2003，體重平均在 200 － 220  g。采用 12  h 晝夜節(jié)律控制( 8: 00 － 20: 00) 。實(shí)驗(yàn)室濕度和溫度均符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)開始前，動(dòng)物在動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng) 7 d，自由飲水，進(jìn)食。

1． 2  實(shí)驗(yàn)材料和試劑

強(qiáng)迫游泳，北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司; 大鼠束縛容器，北京大學(xué)中國**依賴性研究所; 大鼠自發(fā)活動(dòng)箱，上海吉量動(dòng)物儀器公司; 高架十字迷宮，中國醫(yī)科院協(xié)和**所。兔抗 FOS 一抗( Cell Signaling Technology，美國) ，Alexa Fluor 488 羊抗兔 IgG 二抗( Thermo Fisher Scientific，美國) 。

1． 3  PTSD 模型的建立

成年 SD 大鼠，在動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng) 7 d 左右。首先使用硬質(zhì)塑料盒(  使大鼠四肢及軀干束縛在瓶中，尾巴露在外面) 給予大鼠 2 h 的束縛，緊接著讓其在 20 － 24℃ 水溫進(jìn)行 20 min 的強(qiáng)迫游泳，之后休息 15 min，*后用乙醚麻醉直至無抵抗。束縛期間溫度和濕度都與正常飼養(yǎng)環(huán)境一致，待應(yīng)激結(jié)束后分籠放回動(dòng)物房飼養(yǎng)。

1． 4  曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)( open field test，OF)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱是由 75 × 75 × 40 cm ( 長 × 寬 × 高) 的木板制成，底 部均分為 25  個(gè)方格( 15 × 15cm) ，四周墻壁涂黑，緊靠墻的格稱為外周區(qū)域， 其余全部是中央?yún)^(qū)域。實(shí)驗(yàn)測(cè)試出大鼠在箱中中間  格中行走的時(shí)間及在箱中的總路程，用以評(píng)價(jià)大鼠的焦慮狀態(tài)和自發(fā)活動(dòng)狀態(tài)。每次測(cè)試 5 min，測(cè)試后用酒精濕布將迷宮擦拭干凈，去掉**的氣味。每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后均要用 10% 的乙醇將迷宮擦拭干凈。

1． 5  高架十字迷宮( elevated plus maze，EPM)

EPM 是用來考察動(dòng)物的焦慮狀態(tài)。EPM 裝置由兩個(gè)開臂以及兩個(gè)閉臂組成，每個(gè)臂長 50  cm，其中閉臂高 40 cm，寬 10 cm，迷宮高于地面 70 cm。每次實(shí)驗(yàn)時(shí)，將大鼠放在迷宮中間的平臺(tái)上( 10 cm × 10 cm) ，面向開臂。5 min 內(nèi)讓大鼠在迷宮中自由探索。評(píng)價(jià)指標(biāo): 開臂時(shí)間、開臂次數(shù)、閉臂時(shí)間與閉臂次數(shù)，用以評(píng)價(jià)大鼠的焦慮狀態(tài)。在測(cè)試過程中保持暗光操作，每次測(cè)試時(shí)間為 5  min，每次測(cè)完均要用酒精擦拭干凈，去掉**的氣味。

1． 6  樣本準(zhǔn)備和**熒光

將大鼠用****麻醉后用 0． 01  mol·L ^－ 1 的磷酸鹽緩沖鹽水( PBS) 沖洗至肝臟發(fā)白后再用 4% 的多聚甲醛固定，所需的甲醛溶液 pH 值為 7． 4。待大鼠完全僵硬住后，用咬骨鉗剝離大鼠大腦，置于4% 的多聚甲醛溶液中 6 h 進(jìn)行再次固定。隨后將大鼠大腦置于 30% 蔗糖溶液中，進(jìn)行脫水，干冰冷凍固定。使用切片機(jī)冰凍切片( 20 um) ，并儲(chǔ)存在PBS 中。

做**熒光時(shí)，將腦片在 5% 牛血清中室溫封閉 1 h，然后分別加入兔抗 FOS ( 1 ∶ 500) ，4 ℃ 過夜， TBST 漂洗 4 次 × 5 min 后 Alex Fluor 488 － 抗兔 IgG ( 1 ∶ 5000 )   室溫避光孵育 2h，TBST  漂洗 4  次 × 5 min，然后將腦片裱在載玻片上并用抗熒光淬滅劑封片，*后使用熒光顯微鏡觀察 FOS 蛋白表達(dá)變化。

     1.    7 統(tǒng)計(jì)分析

采用 SPSS 18． 0  統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差( x珋± s) 表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析( one － way analysis of variance，ANVOA) ，以 P ＜ 0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

 結(jié)果

     2.     1 大鼠在經(jīng)歷 SPS 應(yīng)激后的焦慮樣行為改變

在曠場(chǎng)測(cè)試中，我們發(fā)現(xiàn)各組大鼠在中間區(qū)停留時(shí)間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異［F( 2，23)  = 11. 82，P ＜ 0. 05，圖 1A］。Post－hoc 分析發(fā)現(xiàn)，同未造模動(dòng)物相比，造模后第 14  d  大鼠在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間顯著縮短( P ＜ 0. 05) ，造模后第 1d 則沒有這種行為學(xué)表現(xiàn)。而且統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)動(dòng)物總的運(yùn)動(dòng)路程并未發(fā)生變化( P ＞ 0. 05，圖 1B) ，表明動(dòng)物在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間的變化不是由于動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)能力受損造成的。

在高架十字測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，各組大鼠在開臂區(qū)停留時(shí)間以及開臂/( 開臂 + 閉臂) 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，統(tǒng)計(jì)值分別為［F( 2，23)  = 4. 44  ，P ＜ 0. 05，圖 2A］和［F( 2，23)  = 5.07，P ＜ 0. 05，圖 2B］。Post － hoc 分析發(fā)現(xiàn)，同未造模組相比造模后第 14  d 大鼠在開臂區(qū)停留時(shí)間及開臂/( 開臂 + 閉臂) 指數(shù)顯著降低( P＜ 0. 05) ，造模后第 1 d 大鼠和正常對(duì)照組相比卻沒有差異性改變。

                              

                                                圖 1 不同處理組大鼠在曠場(chǎng)測(cè)試中的焦慮樣行為

A: SPS 造模 1 d 和 14 d 后，大鼠在曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域的停留時(shí)間; B: 在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，各組大鼠的運(yùn)動(dòng)路程; C: 大鼠曠場(chǎng)十字行為軌跡示意圖。與未造模組相比，*   P ＜ 0. 05，和正常對(duì)照組相比; n = 8。

指數(shù); C: 大鼠高架十字行為軌跡示意圖。^*  P ＜ 0. 05，和正常對(duì)照組相比; n = 8。

                                                  圖 3  不同處理對(duì)大鼠杏仁核腦區(qū) FOS 表達(dá)的影響

A: 大鼠杏仁核腦區(qū); B: SPS 造模 1 d 和 14 d 后，大鼠杏仁核腦區(qū) FOS 的表達(dá)。^*  P ＜ 0. 05，和正常對(duì)照組相比; n = 6 － 7。

       杏仁核是中腦邊緣系統(tǒng)的重要核團(tuán)之一，在危險(xiǎn)察覺、恐懼學(xué)習(xí)記憶及恐懼行為表達(dá)、情感事件記  憶的增強(qiáng)中發(fā)揮重要的作用。應(yīng)激影響杏仁核的結(jié) 構(gòu)和功能的改變，臨床研究表明，在心境障礙患者， 尤其是抑郁癥患者觀察到杏仁核的神經(jīng)解剖學(xué)改 變。其次，應(yīng)激影響嚙齒類動(dòng)物杏仁核的神經(jīng)可塑 性［9］。研究杏仁核的谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)可能在應(yīng) 激作用中作為一個(gè)重要介質(zhì)，調(diào)節(jié)杏仁核從而激活HPA 軸。而本研究發(fā)現(xiàn)大鼠杏仁核在遭受創(chuàng)傷后應(yīng)激后 14 d 而不是 1 d 后激活，而且時(shí)間上是和焦慮樣癥狀的發(fā)生時(shí)間是一致的。綜合前人研究發(fā) 現(xiàn)，我們認(rèn)為杏仁核可能參與了創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙癥 狀的發(fā)生過程，但是這二者之間的因果關(guān)系還需要 通過藥理學(xué)、光遺傳學(xué)等實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步證明。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)大鼠 PTSD 樣癥狀同時(shí)伴隨有杏仁核的激活，這可能參與了 PTSD 樣行為的發(fā)生。這一發(fā)現(xiàn)使我們更好的認(rèn)識(shí) PTSD 癥狀的形成過程， 為今后 PTSD 的防治提供理論依據(jù)。