創(chuàng)傷性應(yīng)激障礙樣大鼠海馬 GABA
創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙 ( post-traumatic stress disor- der，PTSD) 是一種復(fù)雜的焦慮障礙。患者在經(jīng)歷了嚴(yán)重的創(chuàng)傷性事件后，表現(xiàn)出回避性行為，恐懼增強(qiáng)及后覺(jué)醒狀態(tài)［1］。PTSD 的病因復(fù)雜，其機(jī)制的探索首先需要建立一個(gè)良好的動(dòng)物模型模擬PTSD 的特征，即: ①具有短期強(qiáng)烈的應(yīng)激事件;②模擬 PTSD 患者的核心癥狀，即對(duì)創(chuàng)傷性線索的反應(yīng)性增強(qiáng)，過(guò)度覺(jué)醒以及社會(huì)回避表現(xiàn); ③癥狀可持續(xù)存在甚至隨著時(shí)間而增強(qiáng)［2］。單次延長(zhǎng)刺激模型 ( single-prolonged stress，SPS) 能夠較好模擬 PTSD 發(fā)病過(guò)程及患者出現(xiàn)的部分核心癥狀，如逐漸產(chǎn)生的焦慮行為和過(guò)度覺(jué)醒，因此日漸受到研究者的關(guān)注，并廣泛用于 PTSD 的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制研究［3］。SPS 造模［4］是一個(gè)連續(xù)的過(guò)程，這種連續(xù)性應(yīng)激可使動(dòng)物對(duì)條件恐懼僵住反應(yīng)增強(qiáng)，同時(shí)損壞其恐懼記憶的消退功能，*終導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)創(chuàng)傷無(wú)關(guān)的刺激做出過(guò)度的生理和行為反應(yīng)［4］。γ-氨基丁酸 ( γ-aminobutyric acid，GABA) 是**神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，可以調(diào)節(jié)機(jī)體面對(duì)應(yīng)激時(shí)的生理反應(yīng)［5］。GABA 受體包括離子型的 GABAA 和 G-蛋白偶聯(lián)的 GABAB 受體兩種亞型，均在焦慮調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［6］。分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn) GABA 系統(tǒng)和 PTSD 的發(fā)生具有關(guān)聯(lián)性，例如，GABA β3 亞基 3 ＇端的微衛(wèi)星序列的多態(tài)性和 PTSD 的發(fā)生率存在相關(guān)性［7］。另有研究發(fā)現(xiàn) PTSD 患者的腦內(nèi) GABA 水平降低［8］。因此GABA 系統(tǒng)的功能異常可能參與 PTSD 的發(fā)生。海馬是負(fù)責(zé)空間學(xué)習(xí)記憶的重要腦區(qū)，主要功能是將短期記憶固化為長(zhǎng)期記憶以及空間記憶的形成。同時(shí)，大量研究表明海馬也參與應(yīng)激及情緒的調(diào)節(jié)［3］。影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn) PTSD 患者的海馬，同遭受應(yīng)激但是沒(méi)有 PTSD 癥狀的人相比顯著縮小［9］，提示海馬的功能異?？赡軈⑴c PTSD 的發(fā)生。CA1 和CA3 是海馬的重要亞區(qū)，CA3-CA1 突觸傳遞在學(xué)習(xí)記憶和應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。但研究發(fā)現(xiàn)CA3 和 CA1 對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)，如應(yīng)激導(dǎo)致的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng) ( long-term potentiation，LTP) 及一些基因的表達(dá)調(diào)節(jié)是不同的，這取決于應(yīng)激的種類和應(yīng)激時(shí)間［10-11］。因此在本研究中我們將應(yīng)用 SPS 作為 PTSD 的動(dòng)物模型，驗(yàn)證 SPS 所導(dǎo)致的增強(qiáng)的焦慮性行為并觀察其對(duì)海馬 CA1 和 CA3 亞區(qū) GABAA 和 GABAB 受體的蛋白表達(dá)量的影響。
1 對(duì)象與方法
1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
雄性 Sprague-Daw ley ( SD ) 大鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào): S ( 京) 2001 － 2003，體重平均在 200 ～ 220g。采用12 小時(shí)晝夜節(jié)律控制 (8: 00 － 20: 00 )。實(shí)驗(yàn)室濕度和溫度均符合實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，動(dòng)物在動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng) 7 d，自由飲水，進(jìn)食。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為未造模組、SPS 造模 1 d 和SPS 造模 14 d 組，每組各 8 只。經(jīng)過(guò)造模后，SPS 造模 1 d 和SPS 造模14 d 所剩動(dòng)物分別為7 只和6 只。應(yīng)用曠場(chǎng)和高架十字實(shí)驗(yàn)測(cè)試 3 組大鼠的焦慮程度; 行為學(xué)測(cè)試 24 h 后，斷頭取腦檢測(cè) CA3 和 CA1 腦區(qū)GABAA 和 GABAB 的表達(dá)情況。
1. 2 實(shí)驗(yàn)材料和試劑
強(qiáng)迫游泳，北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司; 電泳儀、電泳槽，北京伯樂(lè)生命科學(xué)發(fā)展有限公司; 大鼠束縛容器，北京大學(xué)中國(guó)**依賴性研究所; 高架十字迷宮，中國(guó)醫(yī)科院協(xié)和**所。抗兔GABAA 抗體 ( Abcam，美國(guó))，抗兔GABAB 抗體 ( Abcam，美國(guó))，抗小鼠 β-Actin 抗體 ( 中杉金橋，中國(guó))，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠 IgG抗體 ( 中杉金橋，中國(guó))，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔 IgG 抗體 ( 中杉金橋，中國(guó))。
1. 3 PTSD 模型的建立
成年SD 大鼠，在動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 左右.首先使用硬質(zhì)塑料盒 ( 使大鼠四肢及軀干束縛在瓶中，尾巴露在外面) 給予大鼠 2 h 的束縛，緊接著讓其在 20 ～ 24 ℃ 水溫進(jìn)行 20 min 的強(qiáng)迫游泳， 之后休息15 min，*后用乙醚麻醉直至無(wú)抵抗。束縛期間溫度和濕度都與正常飼養(yǎng)環(huán)境一致，待應(yīng)激結(jié)束后分籠放回動(dòng)物房飼養(yǎng)。
開(kāi)臂區(qū)停留時(shí)間及 EPM 指數(shù)顯著降低 ( P ＜0. 05); 造模 1 d 組差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P ＞ 0. 05) ( 表 2)。
2. 2 大鼠 SPS 應(yīng)激后海馬 CA1 和 CA3 腦區(qū)的 GA- BA 受體表達(dá)水平
Western blot 發(fā)現(xiàn)，不同處理組間 CA1 腦區(qū)GABAA 受體和 GABAB 受體表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Post-hoc 分析發(fā)現(xiàn)，同未造模動(dòng)物相比，造模 14 d 組大鼠 CA1 腦區(qū)的 GABAA 受體和 GABAB 受體的表達(dá)含量顯著降低 ( P ＜ 0. 05 ); 造模 1 d 組差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P ＞ 0. 05) ( 表 3)。
不同處理組間 CA3 腦區(qū) GABAA 受體和 GAB- AB 受體表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Post-hoc 分析發(fā)現(xiàn)，同未造模動(dòng)物相比，造模 14 d 組大鼠 CA3 腦
區(qū) GABAA 受體和 GABAB 受體的表達(dá)含量顯著降低 ( P ＜ 0. 05 ); 造模 1 d 組差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ＞ 0. 05) ( 表 4)。
3 討 論
創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙的臨床癥狀表現(xiàn)多樣，主要是 患者在經(jīng)歷精神創(chuàng)傷性事件后數(shù)天至數(shù)月內(nèi)發(fā)生的 創(chuàng)傷性經(jīng)歷再體驗(yàn)、情感麻木、回避行為和過(guò)度覺(jué) 醒導(dǎo)致的易激惹狀態(tài)［1］。建立效度好的動(dòng)物模型 是研究 PTSD 發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵手段之一，但目前仍無(wú)一個(gè)被廣泛接受的動(dòng)物模型。之前的研究已經(jīng)構(gòu) 建了一些動(dòng)物模型如電擊模型，捕食者場(chǎng)景模型以 及邊緣系統(tǒng)點(diǎn)燃模型等［2］。雖然這些模型在一定 程度上模擬創(chuàng)傷性應(yīng)激，但是對(duì)于一些 PTSD 的關(guān)鍵特征，如由創(chuàng)傷性應(yīng)激導(dǎo)致的時(shí)間依賴性增強(qiáng)的 敏感化表現(xiàn)并不能很好的模擬［4］。有研究表明，
Liberzon 等建立的 SPS 動(dòng)物模型可較好地模擬PTSD 患者出現(xiàn)的恐懼記憶、焦慮反應(yīng)增強(qiáng)、警覺(jué)性明顯增高及相關(guān)神經(jīng)***改變［4］。同時(shí)，經(jīng)歷了 SPS 的動(dòng)物還表現(xiàn)出恐懼記憶消退受損，進(jìn)而導(dǎo)致動(dòng)物對(duì)與創(chuàng)傷無(wú)關(guān)的刺激做出過(guò)度的生理和行為反應(yīng)。因此，SPS 動(dòng)物模型已經(jīng)成為目前常用的PTSD 動(dòng)物模型之一［3］。本研究采用SPS 動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)動(dòng)物經(jīng)歷 SPS 造模后第 1 天的焦慮樣行為無(wú)顯著性變化，而在第 14 天的焦慮樣行為顯著升高，驗(yàn)證了 Serova 等多個(gè)課題組關(guān)于 SPS 可以導(dǎo)致延遲性發(fā)生的焦慮反應(yīng)增強(qiáng)和警覺(jué)度增高的現(xiàn) 象［14］，表明 SPS 模型具有好的效度和重復(fù)性。
有研究指出，海馬在調(diào)控應(yīng)激和焦慮樣行為中發(fā)揮著重要作用［15］。長(zhǎng)期束縛應(yīng)激導(dǎo)致大鼠海馬CA3 亞區(qū)神經(jīng)元樹(shù)突萎縮，動(dòng)物在高架十字迷宮開(kāi)放臂中的探索減少［16］。機(jī)體在遭受應(yīng)激時(shí) CA3- CA1 的 LTP 受損同時(shí)伴隨有 BDNF 的降低［10，17］。臨床研究發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙患者對(duì)環(huán)境性線索 的識(shí)別受損，提示海馬功能受損可能在 PTSD 發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。GABA 是神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性遞質(zhì)，可以防止神經(jīng)系統(tǒng)的過(guò)度激活及谷氨 酸的過(guò)度釋放［18］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激可導(dǎo)致 海馬 CA1 和 CA3 區(qū) GABA 能神經(jīng)元數(shù)量降低［19］， 慢性暴露于應(yīng)激水平的腎上腺皮質(zhì)**導(dǎo)致海馬GABAA 受體亞基表達(dá)異常，但是不同亞基表達(dá)變化在 CA1 和 CA3 區(qū)呈現(xiàn)不同的模式［11］。臨床發(fā)現(xiàn)，GABA β3 3＇端的微衛(wèi)星序列的多態(tài)性和 PTSD的發(fā)生率存在相關(guān)性［7］。本研究發(fā)現(xiàn) SPS 造模 14 d 后海馬 CA1 和 CA3 亞區(qū)中的 GABAA 和 GABAB 蛋白表達(dá)均顯著性降低，這和其焦慮樣行為出現(xiàn)的 時(shí)間點(diǎn)相符，這和前人關(guān)于機(jī)體遭受應(yīng)激 CA3- CA1 的 GABA 遞質(zhì)傳遞調(diào)控異常的研究相一致， 并進(jìn)一步提示海馬的 GABA 受體異常表達(dá)可能調(diào)控 PTSD 部分癥狀發(fā)生，如增強(qiáng)的焦慮及警覺(jué)度。本研究的不足之處是未對(duì) SPS 導(dǎo)致的其他PTSD 樣行為特征如恐懼記憶的形成和消退的影響， 及PTSD 樣行為和 GABA 受體的表達(dá)降低進(jìn)行因果關(guān)系探索。因此，今后的研究中我們將對(duì) CA1 和CA3 腦區(qū) GABA 受體進(jìn)行調(diào)節(jié)， 以便觀察海馬CA1 和 CA3 腦區(qū) GABA 受體的異常表達(dá)是否調(diào)控了大鼠 PTSD 樣行為的產(chǎn)生。