中華中醫(yī)藥學(xué)刊
慢性應(yīng)激對2 型糖尿病大鼠HPA 軸紊亂及海馬損傷的影響
楊蕙1，王宇紅2，張秀麗2，尹玲桃1，孟盼2
( 1． 湖南中醫(yī)藥大學(xué)**附屬醫(yī)院，湖南長沙410007; 2． 湖南省中藥粉體與****省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南長沙410007)
摘要: 目的: 探討慢性應(yīng)激對2 型糖尿病大鼠HPA 軸紊亂及海馬損傷的影響。方法: 采用高脂灌胃聯(lián)合尾
靜脈注射鏈脲佐菌素( STZ) 的方法制備2 型糖尿病動物模型并隨機分為兩組: 一組給予慢性應(yīng)激3 周，另一組不進行慢性應(yīng)激; 同時以空白對照組及慢性應(yīng)激組為對照。造模結(jié)束后，Morris 水迷宮測定動物空間學(xué)習記憶能力; ELISA 法測定血漿皮質(zhì)酮( COＲT) 、促腎上腺皮質(zhì)**( ACTH) 、促腎上腺皮質(zhì)**釋放**( CＲH) 水平; HE染色觀察海馬、下丘腦、垂體和腎上腺形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果: 與正常組比較，糖尿病組、慢性應(yīng)激組及糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠水迷宮實驗逃避潛伏期( EL) 延長，空間探索時間( SET) 縮短; 血漿COＲT、ACTH、CＲH 水平升高; 海馬、下丘腦、垂體和腎上腺形態(tài)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同程度的器質(zhì)性改變; 但是糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠各項指標變化程度具有顯著性意義( P ＜ 0． 05) 。結(jié)論: 慢性應(yīng)激可導(dǎo)致糖尿病大鼠HPA 軸紊亂及海馬損傷，大鼠學(xué)習記憶能力受損可能與此有關(guān)。
關(guān)鍵詞: 2 型糖尿病; 慢性應(yīng)激; HPA 軸; 海馬
中圖分類號: Ｒ － 332 文獻標志碼: A 文章編號: 1673-7717( 2014) 11-2660-04
糖尿病是一種體內(nèi)胰島素分泌**或相對不足，導(dǎo)致血糖過高，出現(xiàn)糖尿，進而引起脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的**。2010 年世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示，全世界約2.85 億糖尿病( diabetes mellitus，DM) 病人，比2007 年增加1.56 億，2030 年預(yù)計可達4. 39 億［1］。糖尿病已成為繼心腦血管病、癌癥之后的第三大殺手。糖尿病的病因及發(fā)病機理較為復(fù)雜，至今尚未完全闡明［2］。近年來，在生物－ 心理－社會新的醫(yī)學(xué)模式下，糖尿病被認為是與心理因素密切相關(guān)的心身**，但對心理應(yīng)激在糖尿病的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中所起的作用還沒有達到統(tǒng)一的認識。隨著應(yīng)激對糖尿病影響研究的逐步深入，精神因素和應(yīng)激事件對糖尿病的影響也越來越為人們所重視［3］。研究表明，外界應(yīng)激主要通過影響機體***紊亂而加重糖尿病的病情。由于應(yīng)激可影響機體的**神經(jīng)系統(tǒng)，如海馬［4］，而**神經(jīng)系統(tǒng)對***，尤其是HPA 軸具有調(diào)控作用［5］，因此推測，慢性應(yīng)激可通過影響機體海馬結(jié)構(gòu)與功能，致***紊亂，HPA軸亢進，進一步影響糖尿病的病程。本實驗通過給予2 型糖尿病大鼠慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激，探討糖尿病大鼠學(xué)習記憶能力，HPA 軸***指標及重要臟器的病理改變，為現(xiàn)代社會糖尿病的發(fā)**展提供新的研究思路。
1 實驗材料與方法
1． 1 藥品與試劑
鏈脲佐菌素( STZ) 由索萊寶公司提供; 高脂乳劑組成:10% 膽固醇、0． 2% 丙硫氧嘧啶、20% 豬油、2% 膽酸鈉、20%吐溫－ 80、20%丙二醇、加蒸餾水至100 mL 配制而成。COＲT、ACTH、CＲH 試劑盒由ＲD 提供。
1． 2 實驗儀器
DB001Morris 水迷宮，北京智鼠多寶生物科技有限責任公司; MK3 型酶標儀，Thermo，美國; ET － 12P 組織脫水機，江西富華生物技術(shù)有限公司; ＲM223 切片機，德國萊卡;DVP －W7 顯微鏡圖像處理系統(tǒng)，南京長城信息系統(tǒng)公司。
1． 3 動物模型的建立及分組
SPF 級雄性SD 大鼠50 只， 180 ～ 200 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號: SCXK( 湘) 2009 －0004; 合格證號: HNASLKJ20102728。除空白組及慢性應(yīng)激組以外，其余大鼠均以高脂乳劑10 mL/kg 連續(xù)灌胃14 d，每天1 次。末次灌胃高脂乳劑后，大鼠禁食不禁水24 h，一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素( STZ，溶于新鮮配制的0． 1mol /L，pH = 4． 5 枸櫞酸緩沖液中，4 ℃保存) 38 mg /kg，正常對照組1 次性尾靜脈注射0． 1 mol /L，pH = 4． 5 枸櫞酸緩沖液，注射體積為2 mL/kg。造模72 h 后，所有大鼠禁食不禁水7 h，測定空腹血糖，從中選取空腹血糖≥16． 00 mmol /L 的大鼠為2 型糖尿病模型。糖尿病模型大鼠隨機分為2組，分別為糖尿病組，糖尿病加21 d 慢性應(yīng)激組，以正常組和慢性應(yīng)激組為對照，每組8 只。慢性應(yīng)激包括4 ℃冰水浴5 min， 45 ℃熱刺激5 min，傾籠45° 24 h，噪音8 h，晝夜
顛倒24 h，潮濕墊料( 200 mL/籠， 24 h) ，夾尾1 min。每天采用一種刺激，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)。造模結(jié)束后進行Morris 水迷宮實驗，實驗結(jié)束后取血測定血漿皮質(zhì)酮( COＲT) 、促腎上腺皮質(zhì)**( ACTH) 、促腎上腺皮質(zhì)**釋放**( CＲH) 水平，HE 染色觀察海馬、下丘腦、垂體和腎上腺形態(tài)學(xué)變化。
1． 4 指標測定
1． 4． 1 Morris 水迷宮Morris 水迷宮被均分為A、B、C、D 4個象限。訓(xùn)練前，水迷宮內(nèi)盛自來水，加墨汁使水變漆黑，檢測前將平臺置于D 象限水面下2 cm，使其在實驗光線下對大鼠不可見。所有實驗均在9 ∶ 00 － 15 ∶ 00 之間進行，且保持室內(nèi)安靜，物品放置及燈光狀態(tài)一致，水溫( 24 ± 1)℃。第1 ～ 4 d 定位航行實驗: 按逆時針方向分別從A、B、C、D 4 個象限將大鼠面向池壁放入水中，觀察并計時60 s，檢測前將平臺置于D 象限正中水面下2 cm。攝像系統(tǒng)記錄大鼠尋找并爬上平臺的時間為逃避潛伏期( evasive latency，EL) ，若60 s 內(nèi)還未找到平臺，則引導(dǎo)其至平臺，停留15s，逃避潛伏期記為60 s。實驗結(jié)束后以4 d 的逃避潛伏期曲線反映大鼠的學(xué)習能力。第5 d 空間探索實驗: 撤除平臺，將大鼠從距原平臺*遠的B 象限面向池壁放入水中，攝像系統(tǒng)記錄大鼠在60 s 內(nèi)各象限游泳時間，以在原平臺所在D 象限游泳時間即空間探索時間( space explorationtime，SET) 作為記憶成績。
1． 4． 2 血漿指標測定10% 水合氯醛3 mL/kg 腹腔麻醉下行腹主動脈取血， 2500 r /min 離心15 min 取血漿保存于－ 80℃ 冰箱，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書測定血漿COＲT、ACTH、CＲH 含量。
1． 4． 3 組織病理學(xué)檢測大鼠取血后，摘取大腦，垂體，腎上腺，立刻經(jīng)4% 福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色，光學(xué)顯微鏡下進行組織形態(tài)學(xué)觀察。
1． 5 統(tǒng)計學(xué)處理
采用SPSS 11． 0 進行統(tǒng)計學(xué)分析。多組間比較用方差分析，每組兩兩比較用q 檢驗，數(shù)據(jù)以珋x ± s 表示。
2 實驗結(jié)果
2． 1 Morris 水迷宮實驗定位航行實驗中，與正常組比較，糖尿病組、慢性應(yīng)激組和糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠的逃避潛伏期均隨著訓(xùn)練時間的延長而有不同程度的延長( P ＜ 0． 05) ; 當實驗進行到第4 d，糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠較糖尿病組和慢性應(yīng)激組的逃避潛伏期顯著延長( P ＜ 0． 05) ，即學(xué)習能力*差。空間探索實驗中，與正常組比較，糖尿病組、慢性應(yīng)激組和糖尿病并發(fā)抑郁癥組的探索時間均有不同程度的縮短，其中慢性應(yīng)激組和糖尿病并發(fā)抑郁癥組時間縮短具有統(tǒng)計學(xué)意義( P ＜ 0． 05) 。結(jié)果表明，慢性應(yīng)激或糖尿病均可在一定程度上導(dǎo)致大鼠學(xué)習記憶能力受損，但糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激后，大鼠學(xué)習和記憶能力衰退*為明顯，結(jié)果見表1。
2． 2 血漿COＲT、ACTH、CＲH 含量測定與正常對照組比較，糖尿病和慢性應(yīng)激大鼠血漿COＲT、ACTH、CＲH 水平均顯著升高( P ＜ 0． 05) 。與糖尿病組和慢性應(yīng)激組比較，糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠血漿
COＲT、ACTH 水平顯著升高( P ＜ 0． 05) ，CＲH 水平僅稍有升高( P ＞ 0． 05) 。結(jié)果表明糖尿病大鼠體內(nèi)存在HPA 軸亢進，**分泌紊亂的現(xiàn)象，慢性應(yīng)激會進一步惡化HPA軸紊亂，結(jié)果見表2。
2． 3 大鼠海馬，下丘腦，垂體，腎上腺病理檢測
2． 3． 1 大鼠海馬形態(tài)學(xué)變化正常大鼠海馬椎體細胞正常排列，形態(tài)正常。糖尿病組、慢性應(yīng)激組和糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠椎體細胞均可見不同程度的胞體固縮，深染及空泡變性，表明海馬細胞存在一定程度的損傷。其中糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組病變*為明顯，結(jié)果見插頁Ⅶ圖1。
2． 3． 2 大鼠下丘腦形態(tài)學(xué)變化正常對照組大鼠下丘腦細胞分布均勻，細胞呈圓形，核/質(zhì)比例等形態(tài)正常。糖尿病組、慢性應(yīng)激組和糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠神經(jīng)元胞體增大，部分出現(xiàn)空泡樣變性，提示下丘腦分泌處于亢進狀態(tài)。其中糖尿病組與糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組病變程度相似，均大于慢性應(yīng)激組，結(jié)果見插頁Ⅶ圖2。
2． 3． 3 大鼠垂體形態(tài)學(xué)變化正常對照組大鼠垂體嗜酸性細胞和嗜堿性細胞分布均勻，分泌ACTH 的嗜堿性細胞分布均勻，形態(tài)正常。糖尿病組、慢性應(yīng)激組和糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠垂體均出現(xiàn)不同程度的嗜堿性細胞數(shù)量增多，細胞體積增加，細胞核深染，竇狀****增多，提示腺垂體分泌處于亢進狀態(tài)。其中糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組病變程度*為嚴重，結(jié)果見插頁Ⅶ圖3。
2． 3． 4 大鼠腎上腺形態(tài)學(xué)變化正常對照組大鼠腎上腺球狀帶和束狀帶分界清晰，分泌糖皮質(zhì)**的束狀帶細胞排列整齊。糖尿病組、慢性應(yīng)激組和糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組大鼠腎上腺球狀帶和束狀帶分界模糊，束狀帶細胞數(shù)量增多，體積增大，胞漿空泡增多，提示腎上腺分泌處于亢進狀態(tài)。其中糖尿病聯(lián)合慢性應(yīng)激組束狀帶細胞病變*為嚴重，結(jié)果見插頁Ⅶ圖4。