改良型**性股骨頭壞死小鼠模型的建立與評價*

王繼濤 1，3 阮紅峰 1，2 付方達(dá) 1，3 吳承亮 1，2△

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)**臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所，浙江 杭州 310053；3.浙江省中醫(yī)院，浙江 杭州 310006）

中圖分類號：R285.5    文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A    文章編號：1004-745X（2017）09-1525-04 doi：10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.007

【摘要】 目的 為建立有效的動物模型，更好研究**性股骨頭壞死的發(fā)病機(jī)制，科學(xué)闡明中**劑**該**的分子作用機(jī)制。 方法 取 45 只 2 月齡雄性 C57BL/6 小鼠隨機(jī)平均分為對照組、傳統(tǒng)組、改良組。  傳統(tǒng)組給予脂多糖聯(lián)合甲強(qiáng)龍**造模，  改良組小鼠則在傳統(tǒng)組基礎(chǔ)上調(diào)整飼料槽的高度，  迫使小鼠主動站立取食，并予跑步機(jī)上跑步 2 h/d；對照組給予等量的生理鹽水。 定時觀察小鼠一般狀況，分別于造模前、造模后第4 周、第 8 周抽血檢測血液中三酰甘油的含量，并于造模后 8 周測量小鼠股骨頭骨密度，次日處死取雙側(cè)股骨頭，體視顯微鏡下觀察股骨頭外觀及色澤。  采用蘇木精-伊紅染色法（HE）及阿爾新藍(lán)染色（ABH）等技術(shù)觀察小鼠股骨頭病理變化。 結(jié)果 傳統(tǒng)組和改良組小鼠精神狀態(tài)明顯差于對照組， 且改良組差于傳統(tǒng)組 （P < 0.05）；傳統(tǒng)組和改良組血液中三酰甘油的含量高于對照組，改良組高于傳統(tǒng)組；骨密度檢測顯示，傳統(tǒng)組和   改良組骨密度低于對照組，且改良組低于傳統(tǒng)組（P   <   0.05）；股骨頭形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)改良組股骨頭軟骨下出血壞死的面積較傳統(tǒng)組嚴(yán)重，HE、ABH 結(jié)果顯示，傳統(tǒng)組有  9  只出現(xiàn)（空骨陷窩數(shù)量增多，骨小梁變細(xì)甚至斷裂）等骨壞死表現(xiàn)，造模成功率達(dá) 60%，改良組有  11  只出現(xiàn)（空骨陷窩數(shù)量增多，骨小梁變細(xì)甚至斷裂）股骨頭壞死的表現(xiàn)，造模成功率高達(dá) 73.3%（P < 0.05）。結(jié)論 傳統(tǒng)造模方法和改良造模方法皆可造模成功，但改良造模方法具有更高成模率。

【關(guān)鍵詞】 **性股骨頭壞死 動物模型 甲強(qiáng)龍 脂多糖 跑步機(jī)

股骨頭壞死（ONFH）是骨科臨床難題之一。 據(jù)流行病學(xué)報道， 在中國每年新增 50~75000 例股骨頭壞死患者［1］。 其中**性股骨頭壞死（SONFH）發(fā)病率占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死的一半以上［2］。 SONFH 發(fā)病好發(fā)于青壯年，具有雙側(cè)高發(fā)病率的特點，且發(fā)病率逐年上升［3-4］；若不能進(jìn)行及時有效地**，70%的患者*終將發(fā)生股骨頭塌陷， 給個人和社會帶來沉重的心理和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［5］。 當(dāng)前 SONFH 確切的發(fā)病機(jī)制和始動因素仍不明確， 因此建立一個全過程高度模擬人類早期SONFH 的動物模型顯得尤為迫切和重要。 本研究參照RyooS 等［6］的方法并加以改進(jìn)，小劑量脂多糖聯(lián)合大劑量甲強(qiáng)龍誘導(dǎo) C57BL/6 小鼠早期股骨頭缺血性壞死， 為研究早期 SONFH 的**和預(yù)防研究提供動物模型。 現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2 月齡 SPF 級雄性 C57 小鼠 45 只， 由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供， 動物許可證號：ACXK（滬）2015-0016。  實驗動物隨機(jī)平均分為 3組：傳統(tǒng)組（**加內(nèi)**組）、改良組（在傳統(tǒng)組的基礎(chǔ)上進(jìn)行站立取食聯(lián)合運動）以及對照組（僅予等量生理鹽水）。

1.2 試劑與儀器 大腸桿菌內(nèi)** （Sigma 公司，美國批號 L2880， 規(guī)格 10 mg）； 甲潑尼龍琥珀酸鈉（ 甲強(qiáng)龍）（Pfizer Manufacturing Belgium NV 公司， 批號： A07056）；光學(xué)顯微鏡（Olympus 公司，日本），Milli-QS超純水器（美國 Millipore 公司），青霉素鈉（華北制藥股份有限公司， 批號：F3117217）；Sartorius BS110S 萬分之一電子天平（德國塞多利斯公司）；INSTRON 萬能材料試驗機(jī)（美國英斯特朗公司），小鼠跑步機(jī)（北京智鼠多寶公司），RM2235 石蠟切片機(jī)、LEICADM500 三目生物顯微鏡及圖像信號采集與分析系統(tǒng)（德國 Leica 公司）。

1.3   模型制備    傳統(tǒng)組小鼠腹腔注射脂多糖 20 μg/kg，每日 1 次，連續(xù)注射 2 d；第 3 天開始臀肌注射 100 mg/kg 的甲強(qiáng)龍，連續(xù)注射 2 周；第 3 周開始隔天注射** 1 次直至取材。 改良組在傳統(tǒng)組基礎(chǔ)上調(diào)整飼料高度迫使小鼠站立取食增加運動，并予跑步機(jī)跑步 2 h/d。 對照組不做任何處理， 并腹腔注射等量的生理鹽水。 所有動物每周臀部注射 3 萬 U 青霉素預(yù)防感染。 造模 8 周后取材（雙側(cè)股骨頭）。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 動物一般體征  注射**后連續(xù) 8 周，  每日觀察各組動物注射后飲食、排便次數(shù)、皮毛光澤、體質(zhì)量、精神狀態(tài)等情況。

1.4.2 小鼠血液學(xué)檢查  分別于造模前、   造模后第 4 周、第 8 周檢測血液中三酰甘油（TG）的含量。 取血方法：戳刺小鼠眼瞼，放血 1 滴，吸取血滴，置于 500 μL 的 EP 管中。

1.4.3 Micro-CT 檢測及骨密度分析 造模后 8 周，各組小鼠分批麻醉放在 Micro-CT 上掃描，對小鼠雙側(cè)股骨進(jìn)行掃描。 通過相應(yīng)分析軟件， 測得小鼠各組股骨頭骨密度。

1.4.4 形態(tài)學(xué)觀察 在無菌條件下，  用 0.02%的*鈉對小鼠（0.2 mL/10 g）進(jìn)行腹腔注射，麻醉后將小鼠仰臥位固定于手術(shù)臺上， 逐層分離直至暴露髖關(guān)節(jié)，取出股骨頭。 用 1×PBS 清洗股骨頭，予體視顯微鏡下觀察雙側(cè)股骨頭外觀及色澤。

1.4.5 組織病理檢查 組織置于 4%多聚甲醛固定 3 d， 流水沖洗過夜，脫鈣 10 d 后，以針頭無阻力刺透為度。隨后進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、進(jìn)行 HE、ABH 染色，光鏡下觀察股骨頭外形、軟骨、骨小梁、軟骨細(xì)胞的變化。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用 SPSS12.0 統(tǒng)計軟件。  計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析。 P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1動物一般體征觀察 造模后，  定時觀察和比較 3 組小鼠的行為學(xué)差異，包括飲食、排便次數(shù)、皮毛光澤、體質(zhì)量、精神狀態(tài)等。 脂多糖腹腔注射后，傳統(tǒng)組和改良組均出現(xiàn)不同程度的精神萎靡。注射**第 3 天后， 除對照組外，傳統(tǒng)組和改良組均出現(xiàn)大便稀溏，飲食和活動均減少的表現(xiàn)。 第 10 天后開始上述癥狀開始減輕，造模期間均未出現(xiàn)潰瘍，脫毛現(xiàn)象，改良組小鼠精神狀態(tài)較傳統(tǒng)組差。對照組與傳統(tǒng)組和改良組比較，對照組小鼠精神狀態(tài)正常，活動自如，飲食正常，皮毛光澤。 各組小鼠體質(zhì)量變化見表 1。 由表可知，**具有能夠減輕小鼠體質(zhì)量的作用，造模后 4、8 周，傳統(tǒng)組和改良組小鼠體質(zhì)量較對照組明顯減輕（P ＜ 0.05），改良組與傳統(tǒng)組體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。

2.2 各組小鼠各時間點 TG 比較 見表 2。 TG 水平在造模前、造模后第 4 周、8 周呈漸增趨勢， 第 4 周傳統(tǒng)組和改良組與對照組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05），傳統(tǒng)組和改良組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）； 第 8 周時，傳統(tǒng)組和改良組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

2.3各組小鼠各時間點股骨頭骨密度比較 見表 3。Micro-CT 顯示，**注射后股骨頭密度逐漸減少。 取材時發(fā)現(xiàn)改良組較傳統(tǒng)組、 對照組兩組更容易發(fā)生骨折，傳統(tǒng)組和改良組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。

2.4 各組小鼠股骨頭形態(tài)學(xué)觀察  見圖 1。  造模 8 周后，對照組股骨頭外觀明亮潔白，關(guān)節(jié)表面光滑；傳統(tǒng)組大部分小鼠股骨頭表面有小面積軟骨下出血壞死； 改良組大部分小鼠股骨頭軟骨下壞死的程度和范圍嚴(yán) 重，軟骨關(guān)節(jié)表面粗糙，出現(xiàn)囊性樣改變。

2.5 各組小鼠股骨頭組織病理學(xué)檢察 圖 2 為 HE 染色，背景為粉紅色，細(xì)胞核為藍(lán)紫色。 對照組小鼠股骨頭形態(tài)正常，骨小梁排列緊密，排列整齊。 傳統(tǒng)組 8周模型小鼠股骨頭外形圓滑，骨小梁排列紊亂，改良組8 周模型小鼠股骨頭，骨小梁排列不規(guī)則，骨髓腔細(xì)胞死亡、脫落。 圖 3 為 ABH 染色，背景為紅色，軟骨為藍(lán)色。 對照組小鼠股骨頭形態(tài)正常，軟骨表面光滑，軟骨基質(zhì)含量較多，染色較深。傳統(tǒng)組小鼠股骨頭骺軟骨區(qū)厚度變薄，軟骨成分含量減少，染色變淺，骨小梁變細(xì)， 部分出現(xiàn)斷裂。 改良組小鼠股骨骺軟骨區(qū)厚度顯著變薄，骨小梁變細(xì)，部分?jǐn)嗔焉踔翂乃?，先前完整的骨骺線開始變得模糊，伴有纖維結(jié)構(gòu)增生，甚至有骨橋形成。

3 討 論

臨床上， 許多**的**都需要長期服用大劑量**類**，例如腎病綜合征，支氣管**，SARS 等， 其帶來的并發(fā)癥股骨頭壞死也是很常見的。 SONFH 的患病人數(shù)也越來越多，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚，且缺乏切實有效的早期診斷和預(yù)防方法。 因此建立與人類SONFH 臨床病理特征相似的動物模型并探索其發(fā)病機(jī)制，尋求有效的**和預(yù)防方法就顯得尤為重要［7］。

SONFH 患者存在共同的病理特征，即在應(yīng)用**前就已經(jīng)有過敏性血管炎［8］。 內(nèi)**使血管內(nèi)皮發(fā)生損傷， 造成血液的流速減慢，血管內(nèi)易凝血的狀態(tài)，在此基礎(chǔ)上大劑量應(yīng)用**更符合臨床發(fā)病特征， 且有更好的成模率［9-10］。  因此，模型建立選擇**聯(lián)合內(nèi)**。

理想的 SONFH 的動物模型應(yīng)具有和人類高度相似的生理、病理、解剖特點， 能夠有效地模擬 SONFH 發(fā)展過程。 當(dāng)前主要用兔和鼠用于 SONFH 造模。 選用小鼠作為實驗動物。小鼠是四肢動物，具有體質(zhì)量輕的特點，雖然難以造成股骨頭塌陷的模型，但是小鼠作為實驗動物有著自身獨特的優(yōu)勢。首先，小鼠的造模時間比較短，其次小鼠的活動空間大便于飼養(yǎng)，調(diào)整飼料槽的位置，使小鼠主動站立取食，模擬人股骨頭的受力狀態(tài)，有利于觀察**的發(fā)展過程。 更重要的是，小鼠與人體的基因具有高度的同源性，這種基因的同源性，使得小鼠生理生化與發(fā)育過程的指標(biāo)與人體大致相似［11］， 從而對環(huán)境及**的反應(yīng)也基本相同。 為此， 選用小鼠作為實驗動物。 常用的造模方法有：單純**、脂多糖聯(lián)合**、異體血清聯(lián)合**等方法［12-14］。 本課題組經(jīng)過前期的預(yù)實驗，發(fā)現(xiàn)**用量在 20~100 mg/kg 的范圍內(nèi)都屬于**用量，相關(guān)研究證實在**范圍內(nèi)， **用量越大骨壞死發(fā)生率越高。 故采用的是脂多糖（20 mg/kg）聯(lián)合大劑量的**（100 mg/kg）同時配合站立取食聯(lián)合運動方法。 本模型具有兩方面優(yōu)勢， 一方面迫使小鼠站立取食，能夠模擬人股骨頭受力［15］。另一方面，運動可以模擬人 SONFH 早期的日常生活狀態(tài)。造模 8 周，B 組 15 只小鼠中出現(xiàn) 9 只股骨頭壞死的表現(xiàn)，成模率達(dá) 60%；而 C 組 15 只小鼠出現(xiàn) 10 只股骨頭壞死的表現(xiàn)；成模率高達(dá) 73.3%，由此可見改良方法優(yōu)于傳統(tǒng)造模方法。 造模過程中未出現(xiàn)小鼠死亡，這可能與無菌的操作習(xí)慣和良好的飼養(yǎng)環(huán)境有關(guān)。

本模型模擬 SONFH 的早期病變，具有以下優(yōu)點： 1）模型誘導(dǎo)時間比較短，SONFH 效果明確；2）實驗動物存活率高，具有較好的成模率；3）與臨床上**性股骨頭壞死的發(fā)病十分相似；4）**聯(lián)合運動方法，能較好地模擬人發(fā)病早期的日常生活狀態(tài)。該模型建立，為早期**性股骨頭缺血性壞死研究提供了可靠的實驗 模型。

綜上所述， 脂多糖聯(lián)合甲強(qiáng)龍加站立喂食聯(lián)合運動方法能夠誘導(dǎo)小鼠早期**性股骨頭缺血性壞死的 發(fā)生，同時具有方法簡單、操作方便，成本低廉，成功率高的特點，有效地模擬 SONFH 早期的發(fā)病過程，所以該方法值得在股骨頭壞死的動物實驗中推廣應(yīng)用。