左歸降糖解郁方對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠海馬神經(jīng)元突觸功能可塑性相關(guān)蛋白的影響
杜青 1，趙洪慶 1，王宇紅 1,2*，徐雅嵐 1，楊蕙 2，孟盼 1
(1.湖南省中藥粉體與****省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)**附屬醫(yī)院，長(zhǎng)沙 410007)
摘要：目的 針對(duì) NR 受體亞型及其下游分子 CaMKII、SynGAP 的表達(dá)情況，探索左歸降糖解郁方對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠海馬神經(jīng)元突觸功能可塑性的影響。方法 復(fù)制糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠模型并隨機(jī)分為 4 組：模型組，陽(yáng)**組(二甲雙胍 0.18 g·kg-1+鹽酸氟西汀 1.8 mg·kg-1)，左歸降糖解郁方高、低劑量組(32.82，8.20 g·kg-1)，以正常大鼠為空白對(duì)照組。采用 Morris 水迷宮檢測(cè)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，Western-blotting 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠海馬 NR2A、NR2B、CaMKII、SynGAP 的表達(dá)情況。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)，空間探索時(shí)間減少(P<0.05)，NR 受體亞型NR2A、NR2B 及 CaMKII、SynGAP 的表達(dá)明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，陽(yáng)**組和左歸降糖解郁方高劑量組逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)，空間探索時(shí)間顯著增加(P<0.05)，NR2A、NR2B、CaMKII、SynGAP 的表達(dá)明顯增多(P<0.05 或0.01)。結(jié)論 左歸降糖解郁方可以明顯增強(qiáng)糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，改善認(rèn)知功能障礙，緩解抑郁癥狀， 該作用可能與調(diào)節(jié)海馬 NR 受體亞型 NR2A、NR2B 及其下游分子 CaMKII、SynGAP 的表達(dá)，保護(hù)海馬神經(jīng)元突觸功能可塑性有關(guān)。
關(guān)鍵詞：糖尿病并發(fā)抑郁癥；左歸降糖解郁方；NR2A；NR2B；CaMKII；SynGAP
糖尿病作為一種***障礙性慢性**正嚴(yán)重影響著人類的生活、健康和生存。全世界約有3.47 億糖尿病患者，而糖尿病并發(fā)抑郁癥(diabetes mellitus with depression ， DD) 的發(fā)生率為8.5%~71.4%[1]，抑郁癥的并發(fā)大大增加了糖尿病的致殘率和致死率。目前，針對(duì) DD 的研究多集中于臨床試驗(yàn)，極少數(shù)涉及其分子機(jī)制，極大地限制了** DD 特效藥的研究及開(kāi)發(fā)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DD 模型大鼠腦內(nèi)谷氨酸異常活化，海馬出現(xiàn)明顯病理結(jié)構(gòu)損傷，海馬神經(jīng)元樹(shù)突、軸突復(fù)雜性降低[2]，廣泛分布于海馬的 NR 受體活化異常，學(xué)習(xí)記憶功能減弱。有文獻(xiàn)報(bào)道，離子形谷氨酸受體 NR 異常活化可調(diào)節(jié) CaMK Ⅱ、SynGAP，影響長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(long-term potentiation， LTP)和長(zhǎng)時(shí)程減弱(long-term decline，LTD)，改變海馬神經(jīng)元突觸功能可塑性[3]。而大腦的學(xué)習(xí)記憶功能與海馬神經(jīng)元突觸可塑性密切相關(guān)。因此， 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè) NR 受體亞型及其下游分子CaMKII、SynGAP 的表達(dá)情況，探索左歸降糖解郁方對(duì)糖尿病并發(fā)抑郁癥模型大鼠海馬神經(jīng)元突觸功能可塑性的保護(hù)作用機(jī)制。
1 材料
1.1 儀器與試藥
OneTouchⅡ型血糖儀及血糖試紙(美國(guó)強(qiáng)生公司)；HI1210 型水浴鍋(Leica 公司)；Mini protean 3 cell 型電泳儀(BIO－RAD 公司)；PS-9 型電轉(zhuǎn)儀 (大連競(jìng)邁科技有限公司)；MK3 型酶標(biāo)儀(芬蘭雷勃公司) ；吉爾森 P 型移液器(Pipetman) ； DB001Morris 水迷宮(北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司)。
左歸降糖解郁方[4]原材料由湖南中醫(yī)藥大學(xué)**附屬醫(yī)院制劑科按比例水煎濃縮后制成口服液 100 mL，建立了一測(cè)多評(píng)的質(zhì)量控制方法，其主要藥效成分分別為黃芪甲苷≥30 μg·mL-1、貫葉金絲桃素≥18 μg·mL-1、姜黃素≥0.4 mg·mL-1、丹酚酸 B≥1.2 mg·mL-1、丹皮酚≥0.2 mg·mL-1。鹽酸二甲雙胍片(湖南湘雅制藥有限公司，批號(hào)： 1402115，規(guī)格：0.25 g)；鹽酸氟西汀膠囊(法國(guó)Patheon，批號(hào)：2087A，規(guī)格：20 mg)；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)(美國(guó) Sigma 公司，批號(hào)： 126A038，規(guī)格：100 mg)，Western blotting **印跡法蛋白抗體 NR2A(批號(hào)：Ab14596)、NR2B(批號(hào)： Ab65783) 、 CaMK Ⅱ ( 批號(hào)： Ab134041) 和SynGap(批號(hào)：Ab3344)均購(gòu)于 Abcam 公司；BCA 蛋白定量試劑盒(Thermo 公司，批號(hào)：PICPI23223)， RIPA 組織細(xì)胞快速裂解液(上?；鶢栴D生物，批號(hào)：BYL40825)。
1.2 動(dòng)物
SPF 級(jí)，♂，SD 大鼠 50 只，體質(zhì)量 180~220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)： SCXK( 湘)2013-0004 ， 合格證號(hào)： 43004700004535。
2 方法
2.1 糖尿病并發(fā)抑郁癥動(dòng)物模型的制備[5]
SD 大鼠連續(xù) 14 d 每天定時(shí)灌胃高脂乳劑(10 mL·kg-1)后，大鼠禁食不禁水 24 h，尾靜脈一次性注射溶于新鮮配制、4 ℃保存的枸櫞酸緩沖液(0.1 mol·L-1、pH4.5)的 STZ 溶液(38 mg·kg-1)，造模 3 d 后，大鼠禁食不禁水 12 h，測(cè)定空腹血糖， 選取空腹血糖≥16.00 mmol·L-1 的大鼠進(jìn)行 28 d 慢性不可預(yù)測(cè)性應(yīng)激。刺激因素包括晝夜顛倒24 h、45°傾籠 24 h、4 ℃冰水浴 5 min、45 ℃熱刺激 5 min、噪音 8 h、潮濕墊料(每籠 200 mL，24 h)、夾尾 1 min。每天進(jìn)行 1 種，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)。
2.2 分組與給藥
將篩選出來(lái)的糖尿病模型大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為 4 組：模型組、陽(yáng)**組(二甲雙胍 0.18 g·kg-1+鹽酸氟西汀 1.8 mg·kg-1)和左歸降糖解郁方高、低劑量(32.82，8.20 g·kg-1)組，各組大鼠慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激造模的同時(shí)灌胃給藥 28 d。另取正常大鼠10 只作為空白對(duì)照組，空白對(duì)照組和模型組給予等體積的生理鹽水。
2.3 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)
將平臺(tái)置于 D 象限，Morris 水迷宮內(nèi)注入剛好沒(méi)過(guò)平臺(tái) 2 cm 的清水(水溫 23~25 ℃)，撒入適量脫脂奶粉減少光反射。第 1~4 天定位航行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)能力，從不同的方位將大鼠面向池壁放入，觀察 60 s 內(nèi)大鼠爬上平臺(tái)的逃避潛伏期(escape latency，EL)，若 60 s 內(nèi)還未爬上，將大鼠引導(dǎo)至臺(tái)上，并記錄 EL 為 60 s。第 5 天空間探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠記憶能力，撤走平臺(tái)，大鼠自對(duì)立象限放入，記錄 60 s 內(nèi)大鼠在 D 象限游泳的時(shí)間， 即為空間探索時(shí)間(space exploration time，SET)。實(shí)驗(yàn)均在上午 8：00~12：00 內(nèi)完成，并保持室內(nèi)其他物體位置不變。
2.4 手術(shù)
24 h 禁食不禁水的動(dòng)物用 10%的水合氯醛(4 mL·kg-1)麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)上，腹腔取血， 斷頭取腦，冷凍臺(tái)上快速分離雙側(cè)海馬于凍存管中，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。Western blotting 檢測(cè) 于EP 管中加入裂解液(每 20 mg 組織加 0.15~0.25 mL 裂解液)，快速放入剪成細(xì)小碎片的海馬組織， 勻漿，離心12 000 r·min-1、4 ℃、15 min)，取上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后-80 ℃保存。BCA 試劑盒中測(cè)定上述提取樣品的實(shí)際蛋白濃度。根據(jù)目的蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量選擇配置 15%濃縮膠與 10%分離膠，上樣(每孔 80 μg)，濃縮膠 80 V、20 min，分離膠120 V、60 min，電泳至標(biāo)記物溴酚蘭到達(dá)凝膠底部即可。采用半干式轉(zhuǎn)膜法將凝膠中的蛋白分子轉(zhuǎn)移到 NC 膜上，用去離子水沖洗 NC 膜，再用麗春紅預(yù)染后，將目的條帶和內(nèi)參條帶裁剪下標(biāo)記后用 TBST 洗去麗春紅。放入裝有 5%的脫脂奶粉液的原位雜交袋中封閉，4 ℃下過(guò)夜。用 TBST 洗滌 3 次后加入相應(yīng)的一抗封閉緩沖液，4 ℃孵育過(guò)夜。再用 TBST 洗滌 3 次后加入二抗封閉緩沖液(1∶1 000)，孵育 1 h(37 ℃)。顯色：濾紙吸干膜上液體，放入 ECL 中進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。Image2X 軟件掃描圖片得出能反映蛋白表達(dá)強(qiáng)度的灰度值。
表 1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶情況結(jié)果( x ± s ，n=8)
2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
數(shù)據(jù)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 16.0，所有計(jì)量資料以 x ± s 表示，組間比較采用單因素方差分析，t 檢驗(yàn)，雙側(cè)檢驗(yàn)， P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3 結(jié)果
3.1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)
與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠 EL 逐漸增加，且后 3 d 差異有顯著性(P<0.01 或 0.05)，SET 顯著減少(P<0.05)。與模型組比較，陽(yáng)**組和左歸降糖解郁方高劑量組大鼠第 4 天的EL 顯著縮短(P<0.05)，SET 顯著延長(zhǎng)(P<0.05)。結(jié)果表明，左歸降糖解郁方高劑量能顯著改善糖尿病并發(fā)抑郁癥大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，緩解抑郁。結(jié)果見(jiàn)表 1。
3.2 Western blotting 檢測(cè)結(jié)果
與空白對(duì)照組比較，模型組 NR 受體亞型NR2A、NR2B 及其下游分子 CaMKII、SynGAP 的灰度值比值顯著增加(P<0.01)。與模型組比較，左歸降糖解郁方高劑量組和陽(yáng)**組 NR2A、NR2B、CaMKII、SynGAP 的灰度值比值顯著減少(P<0.01 或 P<0.05)。結(jié)果提示，左歸降糖解郁方可有效調(diào)控 NR2A、NR2B、CaMKII、SynGAP 蛋白的表達(dá)量。見(jiàn)表 2、圖 1。
