睡眠剝奪對大鼠脾臟**細胞生物鐘基因表達水平的影響
邢陳1 ，顧曄1，2 ，徐秀段1 ，鄒書仙1 ，胡永亮1 ，胡美茹1 ，宋倫1
［摘要］ 目的 探討 72 h 睡眠剝奪( sleep deprivation，SD) 對大鼠脾臟**細胞生物鐘基因表達水平的影響。方法 將大鼠隨機分為正常對照組和SD 組。SD 組大鼠使用SD 儀進行睡眠剝奪72 h 后，取脾臟制備成單細胞懸液， 利用**細胞分離液獲得**細胞; 分別通過 ＲT-PCＲ 和**印跡方法檢測大鼠脾**細胞中生物鐘基因mＲNA和蛋白水平的變化。結(jié)果 與正常對照組相比，SD 組大鼠脾臟生物鐘基因 bmal1、clock、per2、rev-erbα 的mＲNA相對表達水平呈現(xiàn)顯著下調(diào)，而 npas2、per1、rorα、cry1 mＲNA 相對表達水平無顯著變化。與正常對照組相比，72 h SD 后脾臟**細胞 BMAL1、NPAS2、CＲY1、ＲOＲα 蛋白表達水平顯著下調(diào)，PEＲ1 蛋白表達水平呈升高趨勢，而 ＲEV- EＲBα 蛋白表達水平無顯著變化。結(jié)論 72 h SD 應(yīng)激條件可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平誘導(dǎo)大鼠脾多種核心生物鐘基因 表達水平發(fā)生異常改變。
［關(guān)鍵詞］ 睡眠剝奪; 晝夜節(jié)律; 生物鐘; 基因表達; **細胞
晝夜節(jié)律產(chǎn)生和維持的遺傳基礎(chǔ)受控于由一系 列生物鐘基因( bmal1、clcok、cry、per、rev-erbα、rorα、dbp、tef、hlf 等) 構(gòu)成的負反饋環(huán)路［1 ～ 3］。生物鐘基因廣泛存在于機體各**器官、組織和細胞中，使得**細胞遷移和趨化，吞噬、殺傷活性等**功能以及循環(huán)**細胞及其亞群的相對和**數(shù)量、細胞因子水平等多種**參數(shù)呈現(xiàn)顯著的晝夜節(jié)律性變化，從而在維持**穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用［4，5］。
睡眠 － 覺醒周期是機體重要的一種晝夜節(jié)律現(xiàn)象，對維持個體生存和正常生理、心理功能至關(guān)重要。與睡眠 － 覺醒周期節(jié)律性轉(zhuǎn)換相適應(yīng)，細胞因子分泌水平、循環(huán)**細胞數(shù)目、**細胞功能及活性等多個方面都呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性變化［6 ～ 9］。由睡眠剝奪( sleep deprivation，SD) 、睡眠缺失和睡眠相關(guān)**等引起的睡眠節(jié)律紊亂后，機體**功能呈現(xiàn) 顯著異常變化［10 ～ 13］。由于晝夜節(jié)律的遺傳基礎(chǔ)是由生物鐘基因決定的，睡眠節(jié)律紊亂誘發(fā)的**功 能異常應(yīng)與晝夜節(jié)律和生物鐘系統(tǒng)具有密切關(guān)系。脾臟是機體重要的外周**器官，本研究擬定通過SD 誘發(fā)的睡眠節(jié)律紊亂動物模型為研究起點，直接研究 SD 對脾臟生物鐘基因表達的影響，期望闡明睡眠節(jié)律紊亂對脾臟內(nèi)源性晝夜節(jié)律和生物鐘系統(tǒng) 的影響。
1 材料與方法
1． 1 材料
TＲIzol 試劑( Sigma 公司) ; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒( Thermo 公司) ; 瓊脂糖粉( Lonza 公司) ; PBS 緩沖液( Gibco 公司) ; ＲIPA 組織裂解液( 碧云天生物公司) ; 抗 BMAL1、CLOCK、NPAS2、CＲY1、PEＲ1、PEＲ2、ＲOＲα、ＲEV-EＲBα 和 β-ACTIN抗體( Santa Cruz 公司) ; 辣根過氧化物酶標記的羊抗兔、羊抗鼠二抗( 鼎國昌盛生物公司) ; ECL 顯色液( 天根生物公司) 。
1． 2 睡眠剝奪動物模型構(gòu)建
將 12 只 SD 大鼠( 雄性，體質(zhì)量 180 ～ 200 g) 按隨機數(shù)字表法分為正常對照組和 SD 組，每組 6 只。在**科學(xué)院**醫(yī)學(xué)研究院實驗動物中心飼養(yǎng)， 給予12 h 光照/12 h 黑暗交替處理，適應(yīng)環(huán)境7 d 后開始實驗。SD 組大鼠采用 DB036 型 SD 儀( 北京智鼠多寶生物科技有限公司) 進行 SD 處理 72 h。在此過程中，每只大鼠都處于獨立的空間，可自由進食 和飲水。
1． 3 標本采集
在進行 72 h SD 后，用 2% wu***鈉將大鼠麻醉，取脾臟制備成單細胞懸液，利用**細胞分離液分離獲得脾**細胞，分別加入 TＲIzol 和ＲIPA裂解液制備成 ＲT-PCＲ 和 Western 印跡實驗樣品。
1． 4 ＲT-PCＲ
用TＲIzol 抽提脾**細胞總ＲNA 并測定濃度， 按照逆轉(zhuǎn)錄 PCＲ 試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA， PCＲ 擴增 bmal1、clock、npas2、cry1、per1、per2、rev- erbα、rorα 基因。表 1 列出相應(yīng)生物鐘基因引物序列信息。
1． 5 Western 印跡檢測
ＲIPA裂解脾**細胞后，4 ℃ 12 000 r / min離心 30 min，取上清用 BCA 蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。各樣品取等量蛋白進行 SDS-PAGE 電泳，并進行轉(zhuǎn)印。用 5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h，經(jīng)過一抗 4 ℃ 孵育過夜、二抗室溫孵育1 ～ 2 h后，用ECL蛋白顯色液試劑顯色，在暗室紅外光下顯 影，檢 測BMAL1、CLOCK、NPAS2、CＲY1、PEＲ1、PEＲ2 、ＲEV-EＲBα、ＲOＲα 蛋白表達水平變化情況。
1. 6 統(tǒng)計學(xué)分析
利用 SPSS19． 0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用 x珋± s 表示，組間差異比較采用 t 檢驗。P ＜ 0． 05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2 結(jié)果
2. 1 睡眠剝奪對大鼠脾**細胞中生物鐘基因mＲNA 表達水平的影響
為了在轉(zhuǎn)錄水平分析睡眠剝奪對脾**細胞核心生物鐘基因表達的影響，通過 ＲT-PCＲ 檢測正常對照組和睡眠剝奪組大鼠脾**細胞核心生物鐘基 因 bmal1、clock、npas2、cry1、per1、per2、rev-erbα 和 rorα mＲNA 表達水平。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，72 h 睡眠剝奪后脾**細胞中 bmal1、clock 和 rev-rebα mＲNA 表達水平呈現(xiàn)一定程度降低變化，而 npas2、cry1、per1、per2 和 rorα mＲNA 表達水平無顯著改變( 圖 1) 。以上結(jié)果表明，睡眠剝奪應(yīng)激條件下脾各生物鐘基因的轉(zhuǎn)錄活性所受影響存在差異，bmal1、 clock 和 rev-erbα 對睡眠剝奪應(yīng)激因素相對于其他核心生物鐘基因更為敏感。
2．2 睡眠剝奪后大鼠脾**細胞生物鐘基因mＲNA相對表達量的變化
通過灰度掃描對睡眠剝奪后大鼠脾**細胞核 心生物鐘基因 bmal1、clock、npas2、cry1、per1、per2、rev-erbα、rorα mＲNA 表達水平進行相對定量分析，以進一步明確睡眠剝奪對脾**細胞生物鐘基因mＲNA 表達水平的影響。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，72 h 睡眠剝奪后脾**細胞 bmal1、clock、 per2、rev-erbα 的 mＲNA 相對表達水平呈顯著下調(diào)， 而 npas2、per1、rorα、cry1 mＲNA 相對表達水平無顯著變化( 表 2) 。以上結(jié)果進一步表明，睡眠剝奪應(yīng)激條件下脾多種核心生物鐘基因 mＲNA 表達水平受到較為顯著影響，但各生物鐘基因?qū)λ邉儕Z應(yīng) 激因素的敏感性存在差異。
2．3 睡眠剝奪對大鼠脾**細胞中生物鐘蛋白表達水平的影響
為了在翻譯水平分析睡眠剝奪對脾核心生物鐘 基因表達的影響，通過**印跡方法檢測正常組和 睡眠剝奪組中大鼠脾**細胞核心生物鐘基因bmal1、clock、npas2、cry1、per1、per2、rev-erbα 和 rorα 的蛋白表達水平。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，72 h 睡眠剝奪后脾**細胞中 BMAL1、NPAS2、CＲY1、ＲOＲα 蛋白表達水平顯著下調(diào)，PEＲ1 蛋白表達水平呈升高趨勢，而 ＲEV-EＲBα 蛋白表達水平無顯著變化( 圖 2) 。此外，CLOCK 和 PEＲ2 蛋白可能因表達豐度較低在正常對照組和睡眠剝奪組未檢測到較為 顯著的蛋白信號。以上結(jié)果表明，睡眠剝奪應(yīng)激條件下脾多種核心生物鐘基因蛋白表達水平受到顯著影響。
2．4 睡眠剝奪后大鼠脾**細胞生物鐘蛋白相對表達量的變化
通過灰度掃描進一步對睡眠剝奪后大鼠脾** 細胞核心生物鐘蛋白 BMAL1、NPAS2、CＲY1、PEＲ1、ＲEV-EＲBα 和 ＲOＲα 的表達水平進行相對定量分析。結(jié)果顯示，與正常對照組相比，72 h 睡眠剝奪后脾**細胞中 BMAL1、NAPS2、CＲY1 和 ＲOＲα 蛋白表達水平顯著下調(diào)，PEＲ1 蛋白表達水平顯著升高，而 ＲEV-EＲBα 的蛋白表達水平無顯著改變( 表3) 。以上結(jié)果進一步表明，睡眠剝奪應(yīng)激條件下脾多種核心生物鐘蛋白表達水平呈較為顯著的波動變化。
3 討論
睡眠 － 覺醒周期與**系統(tǒng)之間存在交互作用，大量研究主要集中在睡眠對**功能的下行調(diào) 控作用及機制研究，及以**應(yīng)答為起點對睡眠的 上行調(diào)控作用及機制研究。在睡眠對**功能的調(diào) 控作用研究中，睡眠剝奪對**系統(tǒng)晝夜節(jié)律和生 物鐘系統(tǒng)的影響也逐漸受到關(guān)注。前期研究發(fā)現(xiàn)， 睡眠剝奪應(yīng)激條件( 24、36、48 h) 對脾**細胞生物鐘振蕩幅度的影響相對較小。這可能是由于生物鐘 基因的內(nèi)在相互調(diào)控作用使得機體內(nèi)源性生物鐘系 統(tǒng)維持穩(wěn)定。但當繼續(xù)將睡眠剝奪時間繼續(xù)延長至 72 h 后，睡眠剝奪對生物鐘基因振蕩幅度增加或減弱的影響逐漸顯現(xiàn)。本研究中，72 h 睡眠剝奪應(yīng)激條件誘發(fā)的脾多種核心生物鐘基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都可受到顯著影響，但在總體變化趨勢上存在一定差異。在轉(zhuǎn)錄水平，72 h 睡眠剝奪后脾**細胞 bmal1、clock、per2、rev-erbα 的mＲNA 相對表達水平呈顯著下調(diào)，而在翻譯水平 72 h 睡眠剝奪后脾**細胞中 BMAL1、NPAS2、CＲY1、ＲOＲα 蛋白表達水平顯著下調(diào)。以上結(jié)果表明，睡眠剝奪應(yīng)激條件對生物鐘基因表達調(diào)控的影響即可能同時體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平( BMAL1) ，也可能僅單獨體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平或翻譯 水 平 ( CLOCK、NPAS2、PEＲ2、CＲY1、ＲEV-EＲBα、ＲOＲα) 。造成以上結(jié)果的原因，一方面可能是由于生物鐘的表達呈現(xiàn)節(jié)律性振蕩規(guī)律，而在轉(zhuǎn)錄和翻譯過程存在時間錯位，使得生物鐘基因的mＲNA 和蛋白變化趨勢可能在同一時間節(jié)點存在錯位和差異。另一方面，除在轉(zhuǎn)錄水平，生物鐘基因在翻譯、翻譯后修飾和降解機制方面也存在周期性振蕩變化［14 ～ 16］。因此，睡眠剝奪誘發(fā)的脾**細胞clock、npas2、per2、cry1、rev-erbα、rorα 在 mＲNA 和蛋白表達水平的差異變化，可能也是由于睡眠剝奪應(yīng)激因素對以上生物鐘蛋白的翻譯、翻譯后修飾和降解機制方面產(chǎn)生的影響所引起的。
本研究結(jié)果表明，脾多種核心生物鐘基因表達 水平在睡眠剝奪應(yīng)激條件下呈現(xiàn)顯著的異常變化。在本研究體系中，bmal1、clock、npas2、per1、per2、cry1、rev-erbα 和 rorα 都分別在 mＲNA 或者蛋白水平受到不同程度的影響。以上結(jié)果表明，脾作為機體 重要的外周**器官，其內(nèi)源性的生物鐘系統(tǒng)在睡 眠剝奪應(yīng)激條件下發(fā)生一定程度的異常波動。因 此，脾**細胞生物鐘系統(tǒng)表達調(diào)控異常變化也可 視作睡眠剝奪誘發(fā)**系統(tǒng)功能異常的重要早期病 理效應(yīng)之一。